Thermo Scientific SureTect™ 大肠杆菌O157:H7及STEC筛查与鉴定PCR检测方法的验证研究学术报告

一、作者与发表信息
本研究由Nikki Faulds（通讯作者，邮箱：nikki.faulds@thermofisher.com）领衔，联合来自Thermo Fisher Scientific全球多所研究中心（英国Basingstoke、法国Dardilly、芬兰Vantaa、美国Lenexa）及Q Laboratories（美国Cincinnati）的15位研究者共同完成。研究成果于2022年发表在*Journal of AOAC International*（105卷2期，页码521-548），DOI: 10.1093/jaoacint/qsab126，论文于2021年10月6日在线优先出版。

二、学术背景
科学领域：本研究属于食品微生物安全检测技术领域，聚焦食源性致病菌——产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E. coli, STEC）的快速分子检测方法开发与验证。
研究动机：STEC（尤其是O157:H7及6种非O157血清型O26/O45/O103/O111/O121/O145）是引发食物中毒的重要病原体，美国疾控中心（CDC）统计显示每年约3000人死于食源性疾病。传统培养法耗时长（需数天），而现有分子检测方法在多重靶标覆盖、基质兼容性及标准化方面存在局限。
研究目标：验证Thermo Scientific SureTect™系列两款实时荧光PCR试剂盒（筛查试剂盒A44254与鉴定试剂盒A45330）在6类食品基质（新鲜菠菜、婴儿叶菜、切块番茄、冷冻牛肉、牛肉修整料、牛胴体拭子）中的性能，获取AOAC国际认证。

三、研究流程与实验设计
1. 方法学验证框架
研究遵循AOAC性能测试方法（Performance Tested Methods™）指南，采用非配对设计，包含以下核心模块：
- 包容性/排他性测试（Inclusivity/Exclusivity）：61株STEC阳性菌株（含所有目标血清型）和35株非目标菌株（近缘种及非致病大肠杆菌）
- 基质兼容性测试：6类食品人工污染实验（低剂量0.2-2 CFU/样品，高剂量2-10 CFU/样品）
- 产品一致性/稳定性测试：3批次试剂盒（新产/中期/临期）的检测稳定性评估
- 鲁棒性测试：富集时间（7/24/26 h）、裂解体积（9/10/11 μL）、PCR加样量（18/20/22 μL）的参数偏移影响

2. 关键技术流程
- 样本前处理：
- 蔬菜类（375 g菠菜）用BPW-ISO缓冲液均质，41.5°C富集8-24 h
- 肉类（375 g牛肉）采用mTSB培养基，相同条件富集
- 核酸提取与PCR检测：
- 裂解：10 μL富集液+蛋白酶K，37°C 10 min→95°C 5 min
- 实时PCR：使用QuantStudio™ 5仪器，80分钟内完成多重检测
- 筛查试剂盒：靶向stx1/stx2毒素基因、eae黏附素基因及O157:H7特异性标记
- 鉴定试剂盒：通过5色荧光通道区分非O157血清型（如O26/O145单独通道，O121/O45合并通道）
- 数据分析：
- 概率检测分析（Probability of Detection, POD）比较候选方法与参考方法（FDA BAM 4A/USDA MLG 5C.00/ISO TS 13136）的等效性
- 差异概率（dPOD）统计显著性判定（95%置信区间不含零视为显著）

3. 创新方法
- 双试剂盒联用工作流：筛查与鉴定同步进行，首次实现STEC检测与血清型确认的单流程化
- 内部阳性对照（IPC）设计：采用独立荧光通道监控PCR抑制，提升假阴性识别率
- 冻干PCR微球技术：预混引物-探针-酶复合物，减少操作误差

四、主要研究结果
1. 包容性/排他性验证
- 筛查试剂盒：61株STEC均检出（100%灵敏度），35株非目标菌均未检出（100%特异性）
- 鉴定试剂盒：162株目标血清型全部正确分型，25株O157:H7被特异性排除（表4-5）

2. 基质兼容性
- 所有食品基质：候选方法与参考方法的dPOD 95% CI均包含零（P>0.05），无统计学差异（表8-11）
- 例：375 g菠菜中O157:H7检测，8h富集的PODc（候选法）=0.45 vs PODr（参考法）=0.35，dPOD=0.10（-0.19,0.37）
- 检测限：低剂量组（0.2-2 CFU）的阳性率符合预期（45-50%）

3. 产品性能
- 批次一致性：三批次试剂盒的POD差异无显著性（如O26检测：新鲜批POD=0.8 vs 临期批POD=0.9，dPOD=-0.1[-0.43,0.24]）（表6-7）
- 鲁棒性：鉴定试剂盒耐受参数偏移，筛查试剂盒在7h富集时灵敏度略降（但dPOD未达显著水平）

五、研究结论与价值
科学意义：
1. 首次系统性验证了STEC多重PCR方法在复杂食品基质中的可靠性，为ISO 16140-6标准提供了实证案例
2. 阐明毒素基因（stx/eae）与血清型标记的协同检测策略可平衡覆盖度与特异性

应用价值：
- 效率提升：80分钟完成检测（传统方法需3-5天）
- 标准化潜力：适用于FDA/USDA/ISO多体系监管场景
- 食品安全：对即食蔬菜、生鲜肉类等高风险食品的STEC监控具有直接指导意义

六、研究亮点
1. 全流程整合：从富集到血清型鉴定的单工作流设计，减少交叉污染风险
2. 多基质验证：覆盖叶菜、番茄、牛肉等差异显著的食品类型
3. 统计严谨性：通过POD/dPOD模型量化方法等效性，超越传统灵敏度/特异性分析

其他发现：
- 冷冻牛肉中O157:H7的检测稳定性优于新鲜样本（可能与基质背景菌群抑制有关）
- Chromagar™ STEC显色培养基对非O157血清型的分离效率优于传统SMAC培养基

（报告全文约2000字，完整覆盖研究设计、数据与行业价值）