侧流免疫层析技术（Lateral Flow Assays, LFAs）在即时诊断（Point-of-Care, POC）中的超灵敏与高特异性进展综述

本文由Yilin Liu、Li Zhan、Zhenpeng Qin、James Sackrison和John C. Bischof*（通讯作者）合作完成，发表于ACS Nano期刊2021年2月19日第15卷第3593-3611页。文章系统回顾了侧流免疫层析技术（LFAs）在灵敏度和特异性方面的最新研究进展，并探讨了其在传染病防控、环境监测等领域的应用潜力。

核心观点与论据

1. 传统LFAs的局限性及改进需求

传统LFAs因成本低、操作简便和快速检测（<15分钟）被广泛应用于POC诊断，但其灵敏度（微摩尔级，μm）和特异性显著低于实验室标准方法（如酶联免疫吸附试验ELISA：皮摩尔-飞摩尔级，pm−fm；聚合酶链式反应PCR：阿摩尔级，am）。例如，商业化的SARS-CoV-2 LFAs临床准确性（阳性预测值11%–50%）远低于宣称的灵敏度（87%–97.5%），限制了其在疫情控制中的作用。这一问题的根源在于LFAs的检测动力学受限于反应速率（Damköhler数Da=10−4−10−1），且易受非特异性结合（Nonspecific Binding, NSB）干扰。

2. 灵敏度提升策略：优化检测动力学与信号放大

通过优化检测动力学（如反应物浓度、反应时间）和信号放大技术，LFAs的灵敏度可提升至ELISA水平（pm−fm）。具体方法包括：
- 动力学优化：增加反应物浓度（如磁性分离预富集分析物）、延长反应时间（如添加棉线减缓流速）；
- 化学增强：使用新型标记物（如金纳米棒、碳纳米管）或催化反应（如辣根过氧化物酶HRP催化显色）；
- 读取器辅助：通过荧光、表面增强拉曼散射（SERS）或光热成像等物理刺激放大信号。例如，铂纳米催化剂（Au@Pt核壳结构）的LFA对血清中p24蛋白的检测限低至0.8 pg/ml（33 fm），优于商业ELISA。

3. 样本预扩增：实现PCR级灵敏度

通过核酸直接扩增（如等温扩增技术）或间接扩增（如适配体介导的DNA条形码），LFAs可达到PCR级灵敏度（am）。例如，Mirkin课题组开发的“生物条形码”方法通过磁性分离和DNA扩增，将目标蛋白检测限降至30 am。然而，扩增步骤增加了检测复杂性和时间（>30分钟），需进一步开发集成化“样本到结果”设备。

4. 特异性提升：高亲和力分子与CRISPR/Cas系统

减少非特异性结合（NSB）是提高特异性的关键。优化方法包括：
- 样本处理：过滤血细胞或加热灭活干扰物；
- 标记物设计：聚乙二醇化（PEGylation）或硅涂层减少金纳米颗粒聚集；
- 新型亲和分子：纳米抗体（Nanobodies）、短肽或适配体（Aptamers）因其小尺寸和高选择性优于传统抗体。
此外，CRISPR/Cas系统通过特异性识别靶序列，可显著降低假阳性。例如，Cas12a介导的检测平台对临床样本的敏感性和特异性均达100%。

5. 未来展望：快速、超灵敏与多靶标检测的平衡

未来POC诊断需满足三大需求：
- 快速性：检测时间压缩至30分钟内；
- 超灵敏：结合等温扩增与CRISPR/Cas技术实现am级检测；
- 多靶标检测：通过微流控或多重信号读取解决交叉反应问题。例如，垂直流检测（Vertical Flow Assays, VFAs）可提升多靶标检测能力。

论文价值与意义

本文不仅总结了LFAs技术升级的路径，还提出了集成化优化框架（图3），强调信号放大需与动力学优化协同。其科学价值在于揭示了LFAs从“定性筛查”向“定量精准诊断”转型的潜力，应用价值则体现在传染病大规模筛查（如COVID-19）、资源有限地区的医疗部署及环境污染物监测等领域。

亮点与创新

• 技术整合：首次系统比较化学增强、读取器辅助和样本扩增的灵敏度提升效果（图1a）；
  
• CRISPR/Cas应用：提出Cas效应器与LFA联用的高特异性诊断新范式；
  
• 跨学科视角：结合流体力学（Péclet数、Damköhler数）与分子生物学，为LFAs设计提供理论支撑。
  

本文为下一代POC诊断设备的开发提供了全面指导，其核心观点已被多项原型实验验证（如热对比放大技术提升链球菌检测灵敏度），部分成果正通过Vigilant Diagnostics等企业推动商业化。