该文档类型为类型a，即单一原始研究（original research）报告。
研究作者与发表信息
本研究由véronique lenoir、marianne beau yon de jonage-canonico、marie-hélène perrin、antoine martin、robert scholler和bernard kerdelhué等人完成。主要研究机构为法国巴黎第五大学（université rené descartes）生物医学部的神经内分泌实验室（laboratoire de neuroendocrinologie, cnrs-fre2718），以及法国博比尼（bobigny）avicenne医院的病理与细胞学中心（service central d’anatomie et de cytologie pathologique）。该研究发表于《breast cancer research》杂志2005年第7卷第4期，页码为r470–r476，在线发表于2005年4月29日，数字对象标识符（doi）为10.1186/bcr1031。
研究背景
本研究的科学领域为乳腺肿瘤学与神经内分泌学交叉领域。既往研究已充分证明，松果体激素褪黑素（melatonin）除具有昼夜节律调控功能外，在哺乳动物生殖调控中也发挥重要作用。同时，褪黑素在乳腺癌和乳腺肿瘤的发生及生长过程中也具有影响。已有文献报道褪黑素对7,12-二甲基苯并[a]蒽（dimethylbenz[a]anthracene, dmba）诱导的雌性sprague–dawley大鼠乳腺腺癌（adenocarcinoma, adk）具有治疗性抑制作用。然而，关于褪黑素在癌症起始阶段之前的预防性作用——即限制癌症启动频率的能力——尚未得到充分记录。本研究的主要目的是比较褪黑素在限制乳腺癌症启动频率方面的效力与其在癌症启动后抑制肿瘤进展方面的效力。研究通过预防性治疗方案（在给予dmba前仅15天给予褪黑素）与长期治疗性方案（在给予dmba后连续6个月给予褪黑素）进行对照比较。
研究设计与实验流程
本研究采用60只40日龄雌性sprague–dawley大鼠（购自法国charles river公司）。动物在受控温度（20–22°c）和光照条件（12小时光照/12小时黑暗，光照时间为07:00至19:00）下饲养，每笼5只，自由摄食和饮水。经过5天适应后，动物被随机分为三个实验组，每组20只。
第一组为预防性治疗组：动物从45日龄至59日龄每日经灌胃给予褪黑素（10 mg/kg，溶于1 ml的1%羟乙基纤维素中），给药时间控制在熄灯前3小时以内。60日龄时，即停止褪黑素治疗后的次日中午，给予单次灌胃dmba（75 mg/kg，溶于1 ml芝麻油）。第二组为治疗性治疗组：动物在55日龄中午接受单次灌胃dmba（75 mg/kg）。从次日开始，每日经灌胃给予褪黑素（10 mg/kg，同样在熄灯前3小时以内给予），持续6个月。第三组为对照组：动物在55日龄中午仅接受单次灌胃dmba（75 mg/kg），不给予褪黑素治疗。
所有动物在给予dmba后随访12个月。每2周记录可触及的乳腺肿瘤发生情况。肿瘤组织学分析方面，当肿瘤最大直径达到至少2 cm时切除肿瘤，解剖并去除周围结缔组织，置于37%甲醛中固定，石蜡包埋、切片，并采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin）染色。切片由研究作者之一（am）进行病理学检查。观察到的病变从良性到恶性不等，病理表现与人类乳腺肿瘤密切相关。观察到的一般为腺癌（adk），其特征为明显的核不规则和大量有丝分裂。只有明确诊断为腺癌的病变才纳入结果统计。
统计分析方面，首先使用kolmogorov–smirnov和shapiro–wilk检验数据的正态性。由于数据不服从高斯分布，无法使用student’s t检验和welsh检验，因此采用mann–whitney非参数检验。各数据集中诊断为乳腺腺癌的动物百分比采用fisher精确检验（单侧p值）进行比较。此外，还进行了双因素方差分析（anova），以比较加权时间因素后的均值差异。
主要研究结果
双因素方差分析显示，dmba给予后腺癌数量随时间增加（p < 0.01），而两个褪黑素治疗组的腺癌数量均显著减少（p = 0.01）。进一步分析发现，治疗组之间在时间变化上存在差异。
在平均腺癌数量方面，对照组动物在dmba给予后第2至第9个月之间，平均腺癌数量几乎呈线性增加，最高值出现在第9个月，为3.05 ± 0.59。而在褪黑素治疗组中，无论是预防性治疗组还是治疗性治疗组，腺癌数量均显著降低。在dmba给予后12个月，预防性治疗组的平均腺癌数为1.30 ± 0.30，治疗性治疗组为0.95 ± 0.23，而对照组为3.05 ± 0.59。mann–whitney检验显示，治疗性治疗组与对照组之间的差异在6至10个月期间更为显著（0.002 < p < 0.01），但预防性治疗组和治疗性治疗组之间无统计学差异。
在患癌动物百分比方面，对照组中第一例可触及乳腺腺癌出现于dmba给予后2个月。到dmba给予后6个月，对照组75%的大鼠至少出现一个可触及的乳腺腺癌。预防性治疗组和治疗性治疗组的患癌动物百分比均显著降低。dmba给予后6个月，预防性治疗组的腺癌发生率为43%（与对照相比p = 0.04），治疗性治疗组为35%（p = 0.01），而对照组为75%。两个治疗组之间无统计学显著差异。然而，预防性治疗组的抑癌效果持续时间更长：预防性治疗组的抑制作用持续至dmba给予后10个月，而治疗性治疗组的抑制作用持续至7个月。
在每只患癌动物中的平均腺癌数量方面，对照组在dmba给予后第5至第9个月间，每只患癌动物的平均腺癌数几乎呈线性增加，在第9个月达到4 ± 0.6。治疗性治疗组的这一指标在dmba给予后9个月为1.38 ± 0.18，12个月为1.58 ± 0.26，显著低于对照组（4 ± 0.59）（第7至第11个月的p值在0.02至0.05之间，第12个月的p值在0.01至0.02之间）。预防性治疗组的平均腺癌数也低于对照组，但未达到高度统计学显著性。预防性治疗组与治疗性治疗组之间无统计学差异。
结论与研究意义
本研究明确表明，褪黑素对dmba诱导的乳腺腺癌生长具有几乎相同的预防性和治疗性抑制作用。治疗性治疗组在治疗结束时（dmba给予后6个月）的最大抑癌效果为68%，治疗结束后抑制作用逐渐减弱，但直到治疗结束后4个月（dmba给予后10个月）仍具有统计学显著性。预防性治疗组在dmba给予后4个月的最大抑癌效果为62%，其抑制作用持续至dmba给予后7个月，此后不再显著。值得注意的是，在dmba给予后7个月时，预防性治疗组和治疗性治疗组在患癌动物百分比和平均腺癌数量方面均无明显差异，提示仅15天的预防性褪黑素治疗即可产生与6个月治疗性治疗相当的长期抑癌效果。
研究意义方面，褪黑素的抑癌机制可能涉及多个途径，包括调节生殖神经内分泌轴、免疫增强活性、抗氧化特性以及直接抗肿瘤作用。在mcf-7细胞中，褪黑素通过抑制雌激素受体α（erα）表达和反式激活来干扰雌激素反应通路。此外，褪黑素可抑制表皮生长因子（egf）和丝裂原活化蛋白激酶（mapk）诱导的细胞增殖，并促进细胞分化。dmba通过形成代谢产物级联反应，最终生成其致癌形式3,4-二氢二醇-1,2-环氧化物，与dna形成加合物。褪黑素可能通过其自由基清除/抗氧化作用抑制dna加合物的形成，从而减少癌症启动。本研究提示，通过外源性给予褪黑素人为增强昼夜节律强度，可能显著减少dmba引起的dna损伤，从而降低癌症启动频率。
从应用价值角度看，本研究结果提示，在雌性sprague–dawley大鼠中，通过短暂的预防性褪黑素治疗即可长期抑制乳腺腺癌的促进过程。这可能意味着对于由未知环境因素诱导的女性乳腺癌风险，褪黑素也可能具有类似的降低风险作用。这一发现为褪黑素作为乳腺癌预防性干预策略提供了实验依据。
研究亮点
本研究的突出发现是：仅15天的褪黑素预处理即可产生与6个月长期治疗相当的抑癌效果，且其抑制作用可持续至dmba给予后10个月。这一结果在既往文献中尚未被系统记录。此外，研究采用了预防性治疗与治疗性治疗并行的对照设计，能够直接比较褪黑素在癌症启动前和启动后两个阶段的不同作用效力。研究对象为dmba诱导的雌性sprague–dawley大鼠乳腺腺癌模型，该模型是研究激素依赖性乳腺癌的经典动物模型。研究还强调了褪黑素昼夜节律放大在癌症预防中的潜在重要性，为理解昼夜节律与癌症发生之间的关系提供了新视角。
其他有价值内容
本研究还讨论了dmba在乳腺组织中的作用机制。dmba在肝脏和乳腺中通过代谢级联反应生成致癌性代谢物，最终形成dna加合物。由于治疗性治疗组在dmba给予后次日即开始褪黑素治疗，而dmba代谢和dna加合物形成至少在给予后5天内仍持续发生，因此治疗性治疗组的观察结果实际上包含了抑制癌症起始和促进两个阶段的综合效应。这与另一致癌模型——n-亚硝基甲基脲（n-nitrosomethylurea）模型中的发现形成对比：在后者中，褪黑素仅在促癌阶段有效，而在起始阶段无效。此外，已有研究表明dmba可导致昼夜节律紊乱和褪黑素分泌降低，而褪黑素给药可恢复这种昼夜节律缺陷。这些内容进一步支持了褪黑素在癌症预防中的潜在应用价值。