急性髓系白血病（AML）和急变期慢性髓系白血病（BC-CML）的新型关键调控因子：RNA结合蛋白Staufen2（Stau2）的发现与功能解析

作者与机构
本研究由美国加州大学圣地亚哥分校（University of California San Diego）的Jeevisha Bajaj、Michael Hamilton、Yutaka Shima等15位作者共同完成，合作单位包括Sanford再生医学联盟、杜克癌症研究所（Duke Cancer Institute）等。研究成果于2020年4月发表于期刊*Nature Cancer*（Volume 1, pages 410–422）。

学术背景

研究领域与动机
尽管BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs）已显著改善慢性期CML患者的预后，但对急变期CML（BC-CML）和AML的疗效有限，患者生存率不足10%。既往研究表明，Wnt/Smoothened信号通路和RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs，如MSI2、ADAR1）可能参与疾病进展，但尚未在全基因组范围内系统筛选BC-CML的调控因子。本研究旨在通过体内CRISPR/Cas9筛选，鉴定白血病干细胞（Leukemia Stem Cells, LSCs）的关键依赖基因，并揭示其分子机制。

关键科学问题
1. 哪些基因是BC-CML和AML干细胞存活与增殖的必需因子？
2. RNA结合蛋白家族是否在白血病进展中发挥核心作用？
3. 如何通过功能基因组学发现新的治疗靶点？

研究流程与方法

1. 全基因组体内CRISPR/Cas9筛选

研究对象与模型
- 细胞模型：利用BCR-ABL/NUP98-HOXA9驱动的BC-CML小鼠模型（90%为未分化的Lin⁻细胞），模拟高侵袭性白血病。
- 文库设计：使用BRIE全基因组CRISPR文库（Addgene 73633），覆盖约20,000个基因，每个基因设计4-5个sgRNA。
- 实验流程：
- 感染与筛选：将Cas9-GFP⁺的Lin⁻白血病干细胞感染文库病毒，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞。
- 体内验证：将感染细胞移植至亚致死剂量照射的小鼠体内，7天后提取脾脏白血病细胞进行测序分析。
- 数据分析：通过比较输入（pre-selection）、体外筛选后（post-selection）和体内生长后（in vivo）的sgRNA丰度，鉴定必需基因（阈值：体内丰度下降≥3倍）。

关键发现
- 已知依赖基因验证：如MYC、MDM2、WNT1、KDM1A等均被显著富集，证实筛选可靠性。
- RNA结合蛋白（RBPs）的突出作用：695个RBPs中，约680个在筛选中显著富集，提示RBPs是白血病干细胞的核心依赖家族。

2. Stau2的功能验证

候选基因选择
通过表达谱分析，筛选出在LSCs中高表达且未被报道的RBP——双链RNA结合蛋白Staufen2（Stau2）。

基因敲除模型构建
- 小鼠模型：通过CRISPR/Cas9靶向Stau2 exon 4，产生11-bp缺失的移码突变（缺失RNA结合域2-5）。
- 表型分析：
- 稳态造血：Stau2敲除小鼠的造血干细胞（HSCs）数量和功能未受显著影响，但连续移植能力下降，提示其对长期自我更新的潜在作用。
- 白血病模型：Stau2缺失使BC-CML起始能力降低2倍（体外集落形成）或13倍（体内存活率提升，HR=0.075），并显著抑制LSCs的增殖（Ki67⁺细胞减少2倍）。

人类样本验证
- 临床相关性：Stau2在AML复发样本和LSCs中表达升高。
- 功能实验：shRNA敲低Stau2可抑制K562（BC-CML细胞系）、MV-4-11（AML细胞系）及原代患者样本的集落形成能力（降低1.5-23倍），并减少NSG小鼠体内白血病负荷（3倍）。

3. 分子机制解析

eCLIP与RNA-seq整合分析
- Stau2靶标鉴定：在K562细胞中，Stau2结合约2,400个基因的3’UTR茎环结构，富集于染色质组织（如KDM1A、MAZ）、RAS/Wnt信号通路相关基因。
- 下游调控网络：Stau2缺失导致组蛋白去甲基化酶家族（KDM1A/B、KDM5B）表达下调，引起全局H3K4me2/me3甲基化水平升高（1.6-3.4倍）。

功能挽救实验
- KDM1A抑制剂（ORY-1001）：可模拟Stau2缺失的表型（集落形成减少3倍），且对Stau2敲除细胞无叠加效应，证实KDM1A是Stau2的关键下游效应因子。

主要结果与结论

1. Stau2是BC-CML和AML的关键依赖基因：其缺失通过抑制LSCs增殖和促进分化延缓疾病进展。
   
2. 表观遗传调控机制：Stau2通过稳定染色质修饰因子（如KDM家族）的mRNA，调控组蛋白甲基化水平，从而维持白血病干细胞的恶性表型。
   
3. 治疗潜力：靶向Stau2或其下游KDM1A可能为侵袭性髓系白血病提供新策略。
   

研究亮点

1. 创新方法：首次在体内CRISPR筛选中系统性鉴定白血病干细胞的RBP依赖网络。
   
2. Stau2的功能新发现：突破其既往在神经系统的研究局限，揭示其在造血恶性肿瘤中的核心作用。
   
3. 转化意义：提出靶向RNA-表观遗传交叉调控的新治疗思路。
   

价值与展望

本研究通过多组学整合策略，揭示了Stau2-KDM1A轴在白血病干细胞中的关键地位，为克服TKIs耐药提供了潜在靶点。未来需进一步探索Stau2抑制剂的特异性及临床适用性。