南京医科大学附属儿童医院钱晨（Qian Chen）、胡政（Zheng Hu）等研究团队于2018年3月在《International Journal of Clinical and Experimental Pathology》（IJCEP）发表了一项关于儿童白血病融合基因快速分子检测方法的原创研究。该研究开发了一种基于一步法多重逆转录聚合酶链式反应（one-step multiplex RT-PCR）结合毛细管电泳分析系统的创新技术，用于同时检测8种常见的儿童白血病相关融合基因，为白血病的临床诊断、治疗及预后监测提供了高效工具。
研究背景
白血病是一种造血系统恶性克隆性疾病，其发生发展与细胞遗传学异常密切相关。融合基因（fusion genes）作为白血病特异性分子标志物，对疾病分型、治疗方案选择及预后评估具有关键价值。传统的融合基因检测方法（如染色体核型分析、荧光原位杂交技术FISH）存在操作繁琐、耗时长或灵敏度不足等局限性。尽管实时定量PCR（real-time PCR）具有高灵敏度，但难以实现多靶标同步检测。因此，开发一种高效、准确的多重融合基因检测技术具有重要临床意义。
研究方法与技术流程
研究团队设计了一套包含以下核心环节的实验方案：
患者样本与核酸提取
- 研究对象为2014年至2016年确诊的122例中国汉族儿童白血病患者骨髓样本，所有病例均经MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学）标准确诊。
- 采用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单核细胞，通过Trizol试剂提取总RNA，并分装保存于-80°C。
引物设计与验证
- 针对8种常见融合基因（BCR-ABL、ETV6-RUNX1、MLL-AF4、E2A-PBX1、AML1-ETO、PML-RARα、CBFβ-MYH11、SIL-TAL1）及内参基因GAPDH，设计了一套通用引物（universal primers）和10对嵌合引物（chimeric primers）。
- 引物通过Primer Premier 5.0软件设计，并在NCBI Primer-BLAST中验证特异性，扩增片段长度差异均大于50 bp以避免交叉反应。
一步法多重RT-PCR优化
- 反应体系采用单管多重扩增策略：先通过嵌合引物进行靶标特异性扩增（前10-15个循环），随后由高浓度通用引物主导扩增（后20个循环），最终产物通过毛细管电泳（QIAxcel Advanced系统）自动分析。
- 通过正交实验优化引物浓度和反应条件，确定最佳退火温度（58°C、65°C、48°C分段循环）及扩增程序（总耗时约4小时）。
灵敏度与特异性评估
- 使用10倍梯度稀释的质粒标准品（10²~10⁵拷贝/μL）验证灵敏度：AML1-ETO、MLL-AF4和BCR-ABL检测下限达10²拷贝/μL，其余基因达10³拷贝/μL。
- 交叉实验表明，多重体系中对不同融合基因的扩增无相互干扰（图3）。
临床应用验证
- 122例临床样本检测结果显示：与实时定量PCR相比，该方法对CBFβ-MYH11（21/21）、SIL-TAL1（13/13）等融合基因的检出率均为100%，仅1例AML1-ETO阳性样本因低表达未检出（图4）。
- 发现一例ETV6-RUNX1新型变异体，经测序证实其ETV6基因第5外显子缺失及RUNX1基因多外显子断裂（图6-7）。
研究结果与结论
该技术的主要优势体现在：
1. 高效性：单次反应可同步检测8种融合基因，显著缩短检测时间（从传统方法的数天降至4小时）。
2. 高灵敏度与特异性：最低可检测10²拷贝/μL的靶标，且无交叉反应。
3. 临床适用性：通过内参基因GAPDH监控RNA质量及扩增抑制，减少假阴性风险。
研究团队指出，该技术平台尤其适用于白血病初诊分型及微小残留病（MRD）监测，其多重检测能力可为个体化治疗方案的制定提供分子依据。此外，毛细管电泳系统的高通量特性使其适合大规模临床筛查。
创新亮点
- 方法学创新：首次将一步法多重RT-PCR与毛细管电泳联用，简化了传统多重PCR的复杂步骤。
- 临床应用价值：填补了儿童白血病多基因同步快速检测的技术空白，成本低于FISH和单靶标real-time PCR。
- 科学发现：发现ETV6-RUNX1新型断裂模式，拓展了对融合基因变异谱的认知。
研究意义
该研究为白血病分子诊断提供了标准化工具，其技术框架可延伸至其他癌症相关融合基因检测领域。未来通过增加靶标基因数量或联合数字PCR技术，有望进一步提升检测覆盖范围与精度。研究获得南京市科技发展基金（201402022）及南京医学科技发展基金（QRX17078）支持。