本文件为发表于《Trends in Biochemical Sciences》期刊（出版日期：2025年2月15日）的一篇专家观点（Opinion）文章。文章标题为《Small RNA and Toll-like Receptor Interactions: Origins and Disease Mechanisms》，主要作者包括来自美国犹他大学医学院人类遗传学系、分子医学项目等的Jiancheng Yu、Xudong Zhang、Chen Cai，以及来自内华达大学雷诺医学院的Tong Zhou和犹他大学的Qi Chen（通讯作者）。文章系统性地探讨了新兴的多种小型非编码RNA（sncRNAs）作为类似适配体（aptamer-like）的分子，通过其特异性序列、修饰和三维结构与Toll样受体7和8（TLR7/8）相互作用，从而调节免疫反应并参与自身免疫性疾病发病机制的新范式。
文章的核心观点在于挑战了传统上认为sncRNAs仅通过RNA干扰（RNAi）机制发挥功能的观念，提出并论证了sncRNAs能够基于其空间结构，以类似适配体的方式直接与TLR7/8等模式识别受体结合，成为连接RNA生物学与免疫学的重要桥梁。作者进一步提出了一个解释自身免疫性疾病发生与维持的“序贯激活假说”，并探讨了TLR7/8的X染色体定位及其性别偏向性表达在女性高发自身免疫病中的作用。
以下将详细阐述文章的主要观点及其论据：
观点一：sncRNAs的宇宙正在扩张，其功能超越了传统的RNAi机制，能够以适配体样方式发挥作用。 传统观点认为，sncRNAs（如siRNA、miRNA、piRNA）主要通过反义碱基配对靶向序列来介导生物学效应。然而，以PANDORA-seq为代表的新型小RNA测序技术克服了RNA修饰带来的测序偏好，揭示了一个更为丰富和多样的小RNA世界。在多种细胞和组织中，microRNA（miRNA）仅占sncRNA总数的一小部分（%），而tRNA衍生的小RNA（tsRNA）和rRNA衍生的小RNA（rsRNA）成为主导群体，此外还有来源于snRNA、snoRNA、Y RNA、vault RNA等的sncRNAs。许多这类sncRNAs并不与Argonaute（Ago）蛋白结合，也不行使RNAi样功能。它们的长度、末端、修饰以及相对丰度等因素可能导致这种功能分叉。在没有RNAi机制的情况下，这些sncRNAs可以形成复杂的二级和三级结构，使其能够以类似适配体的方式选择性结合蛋白质和其他分子。适配体是能形成特定三维结构的RNA或DNA分子，可高特异性、高亲和力地结合靶标。sncRNAs同样可以利用其RNA修饰和亚细胞环境实现更复杂的结构，从而与更广泛的蛋白质和细胞组件相互作用，影响多种细胞过程。
观点二：多种sncRNAs能够通过与TLR7/8相互作用来调控免疫反应，这种相互作用受RNA序列、修饰和结构的复杂调节。 TLR7和TLR8是位于内体中的模式识别受体，专门识别来自外源（如病毒）和内源的单链RNA。越来越多的研究发现，包括miRNA、tsRNA和rsRNA在内的多种sncRNAs能够与TLR7/8相互作用。这种相互作用很可能通过特定的序列、修饰和结构以适配体样的方式进行。TLR7/8的配体识别具有经典的双位点模型：第一个位点结合核苷（TLR7偏好鸟苷G，TLR8偏好尿苷U），第二个位点结合寡核苷酸（TLR7偏好UU基序，TLR8偏好GU丰富序列）。两个位点的协同作用是激活所必需的。配体结合诱导受体形成闭合二聚体构象，使其胞内TIR结构域能够招募MyD88并形成信号小体，触发下游炎症信号。重要的是，TLR7/8的激活并非“全有或全无”，而是存在程度上的差异，这取决于被激活的受体数量、持续时间以及配体的结合亲和力，允许对炎症反应进行微调。 RNA修饰在此过程中扮演复杂角色。Kariko和Weissman的诺贝尔奖工作表明，某些修饰（如m5C, m6A, m5U, s2U, Ψ）可以降低TLR7/8的激活，这解释了为何修饰水平较低的细菌和线粒体RNA能更强地激活TLR7/8。然而，修饰对TLR7/8活性的影响并非简单的线性负相关。例如，含有四个特定修饰的合成tsRNA-HisGUG与其未修饰版本一样能有效激活TLR7/8；而细菌tRNA中第18位缺乏2’-O-甲基化（Gm18）是触发TLR7的关键，含有该修饰则不能。这表明，修饰的位置及其对RNA结构的影响，而非修饰的数量，才是决定TLR7/8构象变化和激活水平的关键因素。
观点三：sncRNAs进入内体/溶酶体的途径以及局部pH环境深刻影响TLR7/8的激活。 TLR7/8定位于内体/溶酶体膜，其配体结合面向内体腔，因此sncRNAs必须进入此空间才能激活受体。宿主RNA进入内体的途径包括：1）通过新生儿Fc受体（FcRn）依赖的抗体-抗原复合物运输；2）蛋白质（如LL37、HMGB1）介导的转运；3）细胞外囊泡（EVs）递送。此外，内体/溶酶体中的核糖核酸酶（如RNase T2）可以将较长的RNA前体（如mRNA、tRNA、rRNA）加工成更短的sncRNAs（如tsRNA、rsRNA）。 内体成熟为溶酶体的过程伴随着腔内pH从早期内体的约6.0逐渐降至溶酶体的约4.5。这种酸化环境至关重要：低pH是RNase T2等核酸酶活化、加工RNA生成sncRNAs配体的必要条件；同时，低pH也促进TLR7/8在其Z-loop区域的蛋白水解切割，这是其成熟、配体结合和二聚化的关键步骤。因此，能够调节内体/溶酶体pH的分子可以影响TLR7/8的激活。例如，羟氯喹（HCQ）作为一种弱碱，会在酸性区室中积聚并质子化，从而升高pH。这既可能降低酸性核酸酶的活性，减少激活性sncRNAs的生成，也可能阻止TLR7/8的成熟，同时还可能直接结合RNA改变其结构，共同导致其抗炎效应。
观点四：作者提出“序贯激活假说”，以解释sncRNA-TLR7/8相互作用在自身免疫性疾病发生与发展中的两阶段作用。 自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮SLE、干燥综合征SJS）具有女性高发、慢性炎症和常由感染或压力触发的特点。TLR7/8的过度激活已被证明足以驱动此类疾病。文章提出的“序贯激活假说”包含两个阶段： 1. 触发阶段：由感染或压力诱导的异常sncRNAs引发。外部感染或内部因素（如紫外线照射、大规模细胞死亡）导致大量外源性或内源性RNA（通常是非典型片段化的）释放。这些异常的sncRNAs提供了第一波TLR7/8激活，引发炎症反应，包括I型干扰素和促炎细胞因子的释放。这种炎症环境与同时释放的自身抗原（如La、Ro等RNA结合蛋白复合物）共同作用，打破B细胞耐受，激活自身反应性B细胞，产生自身抗体。 2. 维持阶段：由自身抗体介导的免疫原性sncRNAs维持TLR7/8持续激活。第一阶段产生的自身抗体是关键转折点。当这些自身抗体与其对应的自身抗原（大多是含有tRNA、rRNA、Y RNA、snRNA等的核糖核蛋白复合物）结合后，可能会扰乱RNP复合物中RNA的正常降解途径，导致异常切割，产生源自tRNA、rRNA等的异常sncRNAs。这些异常的免疫原性sncRNAs被递送或在内体内生成，进而再次激活TLR7/8，形成一个恶性循环：持续的炎症和自身抗体直接靶向导致更多组织/细胞损伤，释放更多自身抗原，进而刺激产生更多自身抗体和免疫原性sncRNAs，不断激活TLR7/8，使自身免疫反应得以长期维持。
观点五：有证据支持“序贯激活假说”，但完全验证仍需更多直接证据。 文章列举了若干间接证据支持该假说：1）研究表明，SLE患者血清中的自身抗体与包含U1 RNA的小核RNP（snRNP）形成免疫复合物，被浆细胞样树突状细胞（pDC）内吞后，能通过TLR7/8刺激I型干扰素分泌，且此过程依赖于snRNP中的RNA组分（特别是G/U富集序列）。2）在狼疮小鼠模型中，过表达能降解单链RNA的牛RNase I可显著缓解狼疮样症状，证明清除sncRNAs能抑制炎症。3）SLE自身抗原La作为RNA伴侣蛋白，其缺失会改变前体tRNA的折叠，导致从非典型切割位点产生不同的tsRNAs，这说明了自身抗原在控制sncRNA生物发生中的重要性。4）临床研究表明，使用CAR-T细胞疗法清除产生自身抗体的B细胞，在治疗严重SLE等疾病中取得了显著成功，凸显了B细胞和自身抗体在疾病发生中的因果作用。 然而，要完全验证该假说，仍需更多直接证据，例如：证明自身抗体确实能诱导来自自身抗原RNP复合物的sncRNAs发生异常加工；证明这些异常sncRNAs能进入内体并与TLR7/8物理结合激活下游信号；证明打断异常sncRNA的生成或其与TLR7/8的相互作用能够中断炎症和自身抗体产生的恶性循环。
观点六：TLR7/8的X染色体定位及性别偏向性表达是女性高发自身免疫病的重要因素。 大约80%的自身免疫病患者为女性，例如SLE的女男比例高达9:1。除了性激素差异，X染色体基因的剂量效应是关键因素。TLR7和TLR8基因均位于X染色体上。在女性细胞中，虽然存在X染色体失活（XCI）进行剂量补偿，但TLR7/8等基因能够在特定组织和情境下逃逸XCI，导致其在女性免疫细胞中的表达水平高于男性。这种过表达增强了女性免疫细胞对外源和内源sncRNAs的敏感性，可能放大了“序贯激活假说”中的两个阶段，从而增加了女性发生自身免疫反应的风险。 此外，负责XCI的长链非编码RNA XIST本身也可能参与自身免疫。XIST仅在于女性中表达，其与蛋白质形成的RNP复合物可作为自身抗原诱发自身抗体产生。在工程化表达XIST的雄性狼疮模型小鼠中，出现了比野生型雄性更严重的多器官病理，其T、B细胞分子特征也更接近野生型雌性。这进一步强调了自身抗体生成在自身免疫病中的核心作用，并提示XIST RNP复合物一旦被自身抗体靶向，可能产生异常的小RNA片段激活TLR7/8，推动疾病进程。
观点七：理解sncRNA-TLR相互作用具有重要的治疗意义，但也警示了RNA疗法设计的潜在风险。 对sncRNA-TLR7/8相互作用机制的深入理解，为开发治疗自身免疫病的新策略提供了方向：例如，根据患者个体sncRNA谱设计特异性阻断TLR7/8激活的sncRNAs；合成能与TLR7/8结合但不激活它们的竞争性抑制性sncRNAs；开发调节内体/溶酶体pH等局部环境以微调TLR7/8激活的小分子药物。 另一方面，在RNA疗法时代，外源RNA的递送（包括合成sncRNA模拟物、新兴的tRNA疗法、RNA疫苗等）在特定情境下存在无意中激活TLR、引发炎症和自身免疫反应的风险。因此，在设计中必须审慎考虑，例如通过引入特定的RNA修饰或使用绕过内体TLR的递送系统来规避这些风险。
文章的意义与价值： 本文是一篇具有前瞻性和整合性的观点文章，其重要价值在于： 1. 范式转换：推动了对于sncRNA功能的理解，从经典的RNAi机制扩展到基于结构的适配体样功能，尤其是在免疫识别中的重要作用。 2. 机制创新：提出了一个整合性的“序贯激活假说”，为理解复杂自身免疫病的发病（触发）与慢性化（维持）提供了新颖、连贯的分子机制框架，将RNA生物学、自身抗体生成和先天免疫激活紧密联系起来。 3. 连接桥梁：深刻阐述了sncRNA（特别是tsRNA、rsRNA等新兴类别）与先天免疫受体TLR7/8相互作用的分子原理（序列、修饰、结构、环境），搭建了非编码RNA研究与免疫学之间的关键桥梁。 4. 解释疾病特征：从X染色体基因剂量和逃逸失活的角度，为自身免疫病显著的女性倾向性提供了有力的分子解释。 5. 指导转化应用：既指出了基于此机制开发新型免疫调节疗法的潜力，也警示了在开发RNA类药物和疫苗时需注意的免疫原性风险，对基础研究和临床转化均有重要指导意义。文章最后提出的若干“悬而未决的问题”也为该领域的未来研究方向提供了清晰的路线图。