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本文所报道的研究由电子科技大学四川省肿瘤医院与研究所等机构的Dao Fuying、LeBeau Benjamin、Ling Crystal Chia Yin、Yang Mi、Xie Xueqin，以及南洋理工大学的Fullwood Melissa Jane和电子科技大学的Lin Hao、Lyu Hao等人共同完成。论文发表于iMeta期刊2025年第4卷，文章编号e70052，数字对象唯一标识符为doi:10.1002/imt2.70052。

该研究的核心科学领域为三维基因组学与癌症表观遗传调控。染色质相互作用在基因时空表达调控中具有关键作用，尤其是增强子-启动子相互作用（enhancer-promoter interactions，EPIs）能够桥接远端调控元件与靶基因。然而，现有高通量实验技术如配对末端标签染色质相互作用分析（chromatin interaction analysis with paired-end tag，ChIA-PET）和高通量染色体构象捕获（high-throughput chromosome conformation capture，Hi-C）虽然能够绘制染色质相互作用图谱，但成本高昂且技术流程复杂，难以在大规模队列或临床样本中广泛应用。已有计算模型多依赖DNA序列或多种表观遗传学数据集，如染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）和转座酶可及性染色质高通量测序（assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing，ATAC-seq），这些数据同样获取费力。已有研究表明DNA复制时序（replication timing，RT）程序与三维基因组结构存在对应关系，早期复制区域多与转录活跃的A区室重叠，晚期复制区域多与抑制性B区室重叠。基于这一时空耦合关系，作者提出假设：RT可作为独立于DNA序列和表观遗传特征的染色质相互作用预测信号。为此，作者开发了Replichrom模型，以仅利用RT信号预测EPIs，并在多种细胞系和测序平台中验证其性能，同时探索其在癌症相关EPIs识别中的应用价值。

研究的工作流程可分为RT特征分析、模型构建与评估、跨平台验证以及癌症应用四个主要阶段。在第一阶段，作者系统分析了不同细胞系及同细胞系不同个体间的RT模式。结果显示RT具有显著的细胞系特异性，反映了细胞类型特异的染色质结构。癌症样本中异常RT信号可明显区分于正常对照，但在癌症亚型之间差异较小。此外，RT图谱与Hi-C相互作用信号之间存在强对应关系，这为利用RT数据预测EPIs提供了依据。在第二阶段，作者收集了来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的六种细胞系（K562、GM12878、HeLaS3、IMR90、NHEK和HUVEC）的Hi-C原始数据（GSE63525），对相距500 bp以内的相邻增强子或启动子进行合并。阳性EPIs由这些合并区域配对定义，阴性EPIs则从未与Hi-C重叠的配对中选取，并按照1:20的比例进行距离匹配。对于每个增强子-启动子对，作者从上下游侧翼区域提取多窗口尺度的RT特征，最终形成482维的多尺度RT特征集。随后使用随机森林（random forest，RF）分类器进行训练，并通过五折交叉验证和100次随机重采样策略评估模型性能。在第三阶段，作者将Replichrom应用于来自GM12878细胞系的ChIA-PET和高灵敏转座酶介导染色质分析（highly sensitive transposase-mediated analysis of chromatin，Hi-Trac）数据集，以评估模型在不同染色质相互作用检测平台上的泛化能力。同时，作者还利用Hi-C、ChIA-PET和Hi-Trac数据分别训练模型，并将这些模型应用于来自GM12878细胞系的染色体构象捕获碳拷贝（chromosome conformation capture carbon copy，5C）独立数据集，通过整合多个模型的预测结果检验跨平台互补性。在第四阶段，作者将K562细胞系训练的模型应用于急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和正常样本的RT数据，使用FANTOM和ENCODE的增强子与启动子注释生成了超过500万个候选EPIs，并选择预测得分前1000的EPIs进行后续分析。通过对ALL和正常样本的RT谱重新编码这些EPIs，构建样本水平预测矩阵，进而识别ALL特异性、正常特异性和共同EPIs，并进行层次聚类、差异基因表达分析和基因本体（gene ontology，GO）富集分析。

研究结果显示，在第一阶段，RT信号在细胞系间存在明显差异，癌症样本的异常RT模式能够较好地区分于正常对照，并且RT图谱与Hi-C信号高度对应，证实了RT作为三维基因组组织预测特征的潜力。在第二阶段，Replichrom在六种细胞系中均表现出较强的预测性能，AUPRC值超过0.82，AUROC值超过0.94，而基线AUPRC仅为0.05。基于合并数据训练的通用模型进一步提高了性能，AUPRC超过0.88，AUROC超过0.95。跨样本评估显示，由于RT信号的细胞系特异性，跨细胞系预测准确性低于同一细胞系内预测，但通用模型有效缓解了这一变异。在与XGBoost、AdaBoost、决策树、梯度提升、卷积神经网络、长短期记忆网络和Transformer等算法比较中，RF表现最佳。与传统EPIs预测器TargetFinder、JEME、RIPPLE和Lollipop相比，Replichrom在仅使用RT数据的情况下优于大多数方法，并获得与Lollipop相当的性能。仅基于距离训练的模型性能接近基线，表明正负样本之间距离控制良好。特征重要性分析显示，启动子来源的RT信号贡献大于增强子来源的信号。增量特征选择表明，前30个启动子RT特征即可达到最优性能，500 bp窗口提供了最具信息量的信号，而较大窗口则引入噪声。在第三阶段，Replichrom成功预测了GM12878细胞系中超过60%的PolR2A/CTCF ChIA-PET和Hi-Trac独立环状相互作用。高置信度预测富集于H3K27ac和H3K4me3等活性组蛋白标记。使用RT编码的ChIA-PET和Hi-Trac数据集训练的模型均获得较高AUPRC和AUROC，其中PolR2A ChIA-PET模型在跨数据集测试中实现了超过75%的环状相互作用预测准确率。在5C数据集验证中，整合Hi-C、ChIA-PET和Hi-Trac四个模型预测结果后，准确恢复了91个相互作用中的81个，展现了跨平台互补性。在第四阶段，高置信度EPIs锚点富集于H3K27ac、H3K4me3、CTCF、RAD21和PolR2A等活性标记和转录因子。从前1000个K562 EPIs中识别出137个ALL特异性、809个共同和54个正常特异性EPIs，其中ALL特异性EPIs中包含已知癌基因NPM1。基于ALL特异性和正常特异性EPIs预测分数的层次聚类能够完全区分ALL与正常样本，调整兰德指数为1.00，Calinski-Harabasz指数为110.66。进一步分析发现36个与EPIs锚点重叠的ALL相关基因，其中NPM1、CD164、HDAC11等与ALL或急性髓系白血病不良预后相关。差异表达分析识别出15个在ALL中显著上调的基因，包括NPM1等典型ALL发病相关基因。GO富集分析显示这些基因富集于核小体组装和DNA包装等功能。但在区分B-ALL和T-ALL亚型时，基于31个T-ALL和71个B-ALL亚型特异性EPIs的层次聚类分离效果有限，调整兰德指数为0.18，提示ALL亚型间三维染色质相互作用较为保守。

研究结论认为，Replichrom是一个可解释的机器学习框架，能够仅利用DNA复制时序预测多种人类细胞系中的增强子-启动子相互作用。RT在生物学上具有信息量，且在计算上可有效用于长程染色质相互作用建模。Replichrom在Hi-C、Hi-Trac、ChIA-PET和5C等多个平台上均表现出良好的泛化能力，并在仅使用RT输入的情况下取得了与TargetFinder和RIPPLE等现有模型相当或更优的性能。在临床应用中，该模型从ALL样本中识别出多个癌症特异性EPIs，其中多个高置信度EPIs可区分ALL与正常样本，并鉴定出NPM1、CD164、HDAC11和GLUL等白血病相关基因。GO富集分析显示与ALL特异性EPIs相关的基因显著参与染色质组织和巨核细胞分化等过程，提示RT相关EPIs可能构成癌症表观遗传调控的新层面，并为生物标志物发现提供线索。该研究的科学价值在于证明了RT信号可作为三维基因组折叠的独立预测因子，突破了以往模型对DNA序列和多种表观遗传数据的依赖。其应用价值体现在简化了染色质相互作用预测的输入需求，降低了计算成本和技术门槛，同时为癌症特异性调控网络的解析提供了新工具。

本研究的亮点主要包括：第一，首次系统性地仅利用RT信号预测EPIs，摆脱了对序列和多种表观遗传数据的依赖；第二，Replichrom在不同染色质构象捕获技术平台之间展现出良好的泛化能力；第三，将RT预测模型成功应用于急性淋巴细胞白血病样本，识别出NPM1等关键癌基因相关的癌症特异性EPIs，为白血病调控机制研究和潜在生物标志物开发提供了新证据。此外，作者在方法部分指出，未来工作将致力于解决Repli-seq数据的批次效应，并将Replichrom扩展到单细胞和亚型特异性背景中，以捕获调控异质性。