本报告基于发表在*Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis*期刊2005年第38卷588-593页的一篇原创性研究论文。该研究由中国科学院武汉物理与数学研究所（磁共振与原子分子物理国家重点实验室）的Guoyun Bai、Yunhuang Yang、Chaohui Ye和Maili Liu，以及华中师范大学化学系的Yanfang Cui共同完成。论文于2004年10月8日收到，2004年12月13日被接受，并于2005年3月31日在线发表。

一、 研究学术背景

本研究属于生物物理化学和药物分析交叉领域，具体聚焦于药物-蛋白质相互作用研究。药物与血浆蛋白（尤其是人血清白蛋白，Human Serum Albumin, HSA）的结合是决定药物在体内药代动力学（如分布、代谢、排泄）和药效学（如游离药物浓度）的关键因素之一。当两种或多种药物同时存在时，它们可能竞争蛋白质上的相同结合位点，从而改变彼此的游离浓度和药理活性。因此，定量表征两种配体（药物）在蛋白质上的竞争性结合，特别是确定它们共享的（mutual，或称重叠的）和各自特有的（specific）结合位点数量，具有重要的理论和应用价值。

在2005年之前，已有多种技术用于研究配体-蛋白质结合，如平衡透析、超滤、高效液相色谱（HPLC）等。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）光谱法因其非侵入性、无需标记、样品制备简单且能保持样品平衡状态等优点，已成为研究此类相互作用的强大工具，尤其在筛选药物和表征低亲和力结合方面。然而，当时的研究多集中于定性描述竞争性结合现象或高亲和力位点的竞争。对于低亲和力结合，虽然已有快速可逆化学反应（fast and reversible chemical-reaction, FRC）模型用于确定单一配体的结合位点数和解离常数，但缺乏一个能够定量解析两种配体在蛋白质上共享位点和特有位点数量的化学模型。针对这一空白，本研究旨在提出并验证一个用于确定两种配体在蛋白质上相互（重叠）和特异性低亲和力结合位点数量的竞争性低亲和力结合模型（Competitive Low-Affinity Binding model, CLAB）。研究选择HSA作为模型蛋白，因为它是一种主要的血浆药物载体蛋白，对大多数药物具有巨大的结合容量；选择托美丁（Tolmetin, Tol）和水杨酸（Salicylic Acid, Sal）作为模型配体，因为已知它们都能与HSA结合，且共享一个高亲和力位点（Site I），预计在低亲和力位点上也会存在竞争。

二、 详细研究流程

本研究主要包括三个核心流程：模型建立、样品制备与NMR数据采集、以及数据拟合与分析。

第一流程：竞争性低亲和力结合模型（CLAB）的建立。 研究者基于一系列假设建立了一个化学平衡模型。关键假设包括：1) 蛋白质上的所有结合位点是独立的；2) 结合反应（PA + B ⇌ PB + A）在NMR监测的时间尺度上是快速且可逆的；3) 观测到的NMR参数是游离态和结合态配体参数的分数加权平均值；4) 对于每种配体，其在共享位点和特有位点上的解离常数是相同的，但两种配体的解离常数可以不同（KdA ≠ KdB）。 模型推导从质量守恒定律和平衡常数定义出发。设蛋白质P上配体A和B的结合位点数分别为nA和nB，共享位点数为nm，则总独立位点数 n = nA + nB - nm。给定总蛋白浓度Cp、总配体A浓度CA、总配体B浓度CB，以及配体A和B的解离常数KdA和KdB，通过数学推导，最终得到一个关于配体A（或B）结合分数（xb，即结合态配体占总配体的摩尔分数）的三次代数方程。该方程的形式为：xb^3 + a*xb^2 + b*xb + c = 0，其中系数a, b, c是Cp, CA, CB, KdA, KdB和n的函数。通过滴定实验，改变一种配体（如A）的浓度，同时固定另一种配体（B）和蛋白质的浓度，并监测与xb相关的NMR参数（如纵向弛豫率R1）的变化，即可将实验数据拟合到此方程中。在已知KdA, KdB, nA, nB的前提下，通过拟合可求出总位点数n，进而根据公式nm = nA + nB - n计算出共享位点数nm，并得到各自的特有位点数（nA - nm 和 nB - nm）。

第二流程：实验样品制备与核磁共振数据采集。 研究以HSA为受体，Tol和Sal为配体进行模型验证。样品在pH 7.4的磷酸缓冲液中制备，并添加10% D2O用于NMR谱仪锁场。实验设计了两大组（G1和G2）样品，每组包含两个系列，旨在分别考察Tol浓度变化和Sal浓度变化下的竞争效应。 - G1组（变Tol浓度）：系列1（对照）：固定HSA浓度为0.2 mM，Tol浓度变化（4.0, 8.0, 12.0, 16.0, 20.0, 24.0 mM），用于单独研究Tol与HSA的二元体系。系列2（竞争体系）：固定HSA浓度为0.2 mM，固定Sal浓度为4.0 mM，Tol浓度变化（同上），用于研究Sal存在下Tol与HSA的竞争结合。 - G2组（变Sal浓度）：系列3（对照）：固定HSA浓度为0.2 mM，Sal浓度变化（4.0, 8.0, 12.0, 16.0, 20.0, 24.0 mM），用于单独研究Sal与HSA的二元体系。系列4（竞争体系）：固定HSA浓度为0.2 mM，固定Tol浓度为8.0 mM，Sal浓度变化（同上），用于研究Tol存在下Sal与HSA的竞争结合。 此外，还制备了不含HSA的Tol和Sal混合溶液，用于测定游离配体的本征弛豫率（R1f）。 所有质子纵向弛豫率（R1）的测量均在298 K温度下，使用Varian Inova 500 MHz NMR谱仪完成。采用传统的反转恢复序列进行测量。对于含HSA的样品，测量Tol和Sal的R1时分别使用了16个随机分布在0.01-5秒和0.03-10秒间的恢复延迟。对于不含HSA的样品，使用了30个0.2-20秒的恢复延迟。通过拟合信号强度随恢复延迟变化的曲线（A(t) = A∞ - [A∞ - A(0)] * exp(-R1 * t)）来提取R1值，实验误差通常小于5%。

第三流程：数据拟合与分析。 此流程分为两个层次：首先利用FRC模型处理二元体系数据，获取单一配体的表观结合参数；然后利用CLAB模型处理三元竞争体系数据，获取共享位点信息。 1. 二元体系分析（确定nA, nB, KdA, KdB）：使用系列1（Tol-HSA）和系列3（Sal-HSA）测得的R1obs数据。根据FRC模型，结合分数xb = (R1,obs - R1f) / (R1b - R1f)，其中R1b为完全结合配体的弛豫率，可通过外推法从R1obs对浓度比的曲线中估算。将xb与配体/蛋白浓度比（Cl/Cp）的关系代入FRC模型方程进行非线性拟合，即可得到每种配体在HSA上的表观结合位点数（n）和解离常数（Kd）。拟合结果显示，Sal的n值为32 ± 4，Kd为2.68 ± 0.48 mM；Tol的n值为28 ± 2，Kd为1.75 ± 0.24 mM。这些结果与文献报道一致，验证了实验体系的可靠性。 2. 三元竞争体系分析（确定n和nm）：使用系列2（变Tol，固定Sal）和系列4（变Sal，固定Tol）测得的R1obs数据。首先，根据公式xb = (R1,obs - R1f) / (R1b - R1f) 计算不同浓度下配体的结合分数（xb）。然后，将xb对滴定配体浓度的变化曲线，代入之前建立的CLAB模型方程（即三次方程）进行拟合。此时，方程中的KdA和KdB使用上一步从二元体系得到的结果（Kd_Sal和Kd_Tol），nA和nB也使用上一步的结果（n_Sal和n_Tol）。需要根据两种配体Kd的相对大小选择正确的方程解形式（Kd_Sal > Kd_Tol，因此对于变Tol的滴定用方程10a，对于变Sal的滴定用方程10b）。拟合的目标是优化总位点数n。通过拟合系列2的数据（Tol结合分数随Tol浓度变化），得到总位点数n = 43 ± 2，进而计算共享位点数 nm = n_Sal + n_Tol - n = 16 ± 5。通过拟合系列4的数据（Sal结合分数随Sal浓度变化），得到 n = 42 ± 4，nm = 18 ± 6。综合两次独立测量的结果，取平均值得出：对于Sal和Tol在HSA上的竞争结合，总独立结合位点数 n = 42 ± 3，共享（重叠）结合位点数 nm = 17 ± 5。

三、 主要研究结果

1. 模型验证成功：提出的CLAB模型能够有效地用于分析两种配体在蛋白质上的竞争性低亲和力结合。通过两组独立的滴定实验（分别改变Tol和Sal浓度），拟合得到的总结合位点数（42±3 vs 43±2/42±4）和共享位点数（17±5 vs 16±5/18±6）高度一致，证明了模型的自洽性和适用性。
2. 具体的结合位点定量结果：
   • 水杨酸（Sal）在HSA上约有32 ± 4个低亲和力结合位点。
   • 托美丁（Tol）在HSA上约有28 ± 2个低亲和力结合位点。
   • 两者共享（重叠）的结合位点约有17 ± 5个。
   • 因此，Sal特有的结合位点数约为 32 - 17 = 15个，Tol特有的结合位点数约为 28 - 17 = 11个。
3. 重要的科学发现：研究结果表明，尽管HSA对大多数配体具有巨大的结合容量（数十个低亲和力位点），但这些位点中仍有相当一部分（在本例中，Sal和Tol共享了各自约53%和61%的位点）是具有结构选择性的。这意味着不同结构的药物分子会竞争这些共享位点，从而可能产生药代动力学上的相互作用。同时，也存在相当数量的特异性位点，这些位点可能对配体结构有更高要求，不易被其他分子竞争。
4. NMR观测的竞争证据：NMR谱图直接显示了竞争现象。在只有HSA和一种配体时，配体质子的谱峰因结合而发生明显的线宽增加和化学位移变化。当加入第二种竞争配体并逐渐增加其浓度时，第一种配体的谱峰线宽变窄、化学位移向游离状态回归，这表明第二种配体将第一种配体从其结合位点上置换了下来，直观证实了竞争性结合的发生。

四、 研究结论与价值

本研究成功建立并验证了一个名为CLAB的化学模型，用于定量确定两种配体在蛋白质（或其他大分子）上的相互（重叠）和特异性低亲和力结合位点数量。该模型通过结合滴定实验和光谱参数（如NMR弛豫率）监测，并利用推导出的数学方程进行数据拟合来实现定量分析。

科学价值：该研究填补了当时在定量解析低亲和力竞争结合位点方面的空白，将竞争性结合研究从定性或高亲和力单一位点水平，推进到了多低亲和力位点的定量化水平。它提供了一个通用的分析框架，可应用于任何符合模型假设的配体-受体竞争体系。

应用价值：在药物研发和临床药理学领域，该方法可用于更精确地预测和评估药物-药物相互作用（DDI）的潜力。通过定量了解两种候选药物或已上市药物在关键转运蛋白（如HSA）或靶点蛋白上共享位点的比例，可以更好地评估它们联合用药时因蛋白结合竞争而导致游离浓度变化的风险，从而指导合理的给药方案设计或药物结构优化。

五、 研究亮点

1. 模型创新性：首次提出了一个专门用于定量确定两种配体在蛋白质上共享与特有低亲和力结合位点数量的化学平衡模型（CLAB），具有方法论上的创新性。
2. 方法的实用性与普适性：该方法基于常用的滴定实验和光谱技术（如NMR），无需特殊标记或破坏样品平衡，具有较好的实用性和潜在普适性，可推广至使用其他光谱技术（如荧光、紫外）的研究中。
3. 清晰的定量结果：研究不仅证明了竞争的存在，更重要的是给出了明确的定量结果（共享17±5个位点），深化了对HSA这种重要药物载体蛋白结合特性的理解，揭示了其低亲和力位点兼具“容量大”和“有选择性”的双重特征。
4. 严谨的实验设计：通过两组对称的、相互验证的滴定实验（分别改变两种配体的浓度）来应用模型，增强了结果的可靠性和说服力。

六、 其他有价值的内容与讨论

论文在讨论部分也坦诚地指出了模型的局限性和实验中的误差来源： - 模型简化：CLAB模型假设只形成二元复合物（PA或PB），而忽略了在同一个足够大的结合位点上形成三元复合物（如Sal-HSA-Tol）的可能性。这种共结合（co-binding）如果存在，会使模型复杂化。作者指出，在当前工作中仅关注二元复合物是为了简化分析。 - 应用范围扩展：理论上，只要游离态与结合态的交换速率在监测方法的时间尺度上是快速的，该模型也可应用于中高亲和力的竞争性结合分析。 - 误差来源分析：作者详细分析了可能的误差来源，包括：NMR弛豫率测定本身约2-6%的不确定性；蛋白质背景信号和分子间核奥弗豪泽效应（NOE）可能对R1值的影响；外推R1b值约有10%的误差；拟合n值约有15%的误差。这些误差累积导致最终共享位点数nm的不确定性约为30%。作者指出，增加实验数据点可以改善结果的精度。 - 干扰因素控制：为尽量减少pH、温度、离子强度、变构效应等其他因素对NMR参数的影响，实验在恒温、统一缓冲液条件下进行，并使用高配体/蛋白浓度比以增强低亲和力结合引起的弛豫变化信号，同时减弱变构效应的影响。

这项研究在药物-蛋白质相互作用分析领域做出了实质性的贡献，其提出的CLAB模型和相关实验策略为后续更精细的竞争性结合研究提供了有价值的工具和思路。