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铅污染检测新方法：基于DNAzyme和CRISPR/Cas12a的创新研究
本研究的主要作者包括任凯元（Kaiyuan Ren）、丁盛（Sheng Ding）、施金毅（Jinyi Shi）、董娟（Juan Dong）、杜峰（Feng Du）和唐卓（Zhuo Tang），他们分别来自中国科学院成都生物研究所天然产物研究中心、成都大学临床医学院及附属医院，以及中国科学院大学。该研究于2025年在《Talanta》期刊上发表。
学术背景与研究目的
铅离子（Pb²⁺）污染是重金属污染的重要表现形式之一，主要来源于工业活动、汽车尾气排放以及日常生活中含铅产品的广泛使用。长期暴露于高浓度Pb²⁺会对人体健康造成严重威胁，尤其是对儿童神经系统发育的影响可能导致认知障碍甚至死亡。因此，环境中的Pb²⁺污染预防与监测至关重要。然而，传统检测方法如光谱法和电感耦合等离子体技术（ICP）虽然灵敏度高，但需要昂贵设备、复杂样品制备过程以及高昂维护成本。为解决这些问题，研究人员开发了一种基于DNAzyme（脱氧核酶）和CRISPR/Cas12a蛋白的新方法，旨在实现快速、低成本且高特异性的Pb²⁺检测。
详细实验流程
本研究主要包括以下步骤：
材料准备与试剂设计
研究团队首先合成了所有实验所需的寡核苷酸序列，并通过高效液相色谱（HPLC）或高亲和纯化（HAP）进行纯化。这些序列包括GR-5 DNAzyme（一种对Pb²⁺具有高特异性的DNAzyme）、Cas12a激活序列（split activator）及其相关探针。此外，还使用了T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）以去除切割后产生的2′,3′-环状磷酸基团。
优化反应条件
信号放大与背景抑制策略
传统DNAzyme-Cas12a系统存在因“DNA呼吸”现象导致的背景信号问题。为此，研究团队设计了一种包含flap区域的split activator（分裂激活子），通过抑制Cas12a的非特异性切割活性来降低背景噪声。具体而言，在Pb²⁺存在时，GR-5 DNAzyme会切割flap区域，从而重新构成完整的Cas12a激活序列并触发其转切割活性；而在无Pb²⁺情况下，flap区域保持完整，抑制Cas12a激活。
实际样品检测
为了验证方法的实际应用价值，研究团队将该方法应用于实验室自来水和饮用水样本中Pb²⁺的检测。通过向样本中添加不同浓度的Pb²⁺（10 nm、20 nm、40 nm），评估了方法的定量能力和准确性。
主要结果
1. 背景信号显著降低
实验表明，采用flap-containing split activator的设计能够有效抑制Cas12a的协同激活效应，从而显著提高信噪比。与传统方法相比，该设计实现了四倍以上的改进。
高灵敏度与特异性
在优化条件下，该方法对Pb²⁺的检测限达到615 pmol/L，并表现出良好的线性关系（1–60 nm范围内）。同时，其他金属离子（如Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺和Zn²⁺）几乎不引起信号变化，证明了方法的高特异性。
实际样品检测结果可靠
在模拟真实水样检测中，该方法成功区分了受污染样本与未污染样本，且回收率范围为92.4%至99.3%，相对标准偏差（RSD）均低于5%。这表明该方法具有较高的准确性和实用性。
结论与意义
本研究开发了一种基于DNAzyme和CRISPR/Cas12a的新型Pb²⁺检测方法，具有简单、快速、低成本和高特异性的特点。该方法无需DNA扩增或纳米粒子修饰即可实现超灵敏检测，适用于实际水样中的Pb²⁺污染监测。此外，由于其高度可编程性，该方法还可通过替换特定DNAzyme或其他功能性核酸传感模块扩展到其他分析物的检测，展现了广阔的应用前景。
研究亮点
1. 创新性地设计了含有flap区域的split activator，有效解决了传统方法中由“DNA呼吸”引起的背景信号问题。
2. 方法灵敏度高达615 pmol/L，优于许多现有技术，且操作简便、成本低廉。
3. 在实际水样检测中表现出优异的准确性和可靠性，为环境监测提供了有力工具。
其他有价值内容
本研究不仅推动了CRISPR/Cas12a生物传感器的发展，还为重金属污染监测领域提供了新的思路和技术支持。未来，这种方法有望进一步应用于食品、土壤等其他介质中的Pb²⁺检测，为公共健康保障贡献力量。