标题：CRL3^(KCTD10) 泛素连接酶-USP18去泛素化酶轴通过调控SLC7A11协同调控半胱氨酸摄取与铁死亡
作者与发表信息
本研究的主要作者为来自浙江大学医学院附属第二医院癌症研究所（浙江大学医学院转化医学研究所、浙江大学癌症中心）的周祺银、于鸿飞、陈永霞、任佳怡、卢雁和孙毅教授团队。论文《The CRL3^(KCTD10) ubiquitin ligase–USP18 axis coordinately regulates cystine uptake and ferroptosis by modulating SLC7A11》于2024年7月3日发表在国际著名学术期刊《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》(PNAS)上，卷期为第121卷第28期，文章识别号为e2320655121。
学术背景
本研究隶属于细胞生物学与癌症生物学领域，聚焦于程序性细胞死亡——铁死亡(Ferroptosis)的调控机制。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的独特细胞死亡形式，因其在选择性杀伤某些癌细胞和克服癌症治疗抵抗方面的潜力而备受关注。
半胱氨酸转运蛋白SLC7A11是系统Xc-的重要组成部分，负责将胞外的胱氨酸（半胱氨酸的二聚体）转运至细胞内。胱氨酸随后被还原为半胱氨酸，用于合成关键的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的必需辅因子，GPX4负责清除脂质过氧化物，从而抑制铁死亡。因此，SLC7A11被认为是调控铁死亡的关键节点分子。在许多人类疾病，尤其是癌症中，SLC7A11的表达常出现异常上调，导致癌细胞对铁死亡的抵抗性增强，从而促进肿瘤发展和治疗抵抗。
尽管SLC7A11的重要性已被广泛认识，但其蛋白质稳定性是如何在生理和病理条件下被精准调控的，尤其是响应环境胱氨酸水平变化的协调调控机制，尚不清楚。蛋白质的稳态通常由泛素-蛋白酶体系统(UPS)动态平衡，其中E3泛素连接酶负责标记靶蛋白使其被降解，而去泛素化酶(DUB)则负责移除泛素链以稳定靶蛋白。然而，调控SLC7A11稳定性的特定E3-DUB对及其在胱氨酸饥饿等应激条件下的作用机制仍是悬而未决的问题。
基于此，本研究旨在：1）鉴定负责SLC7A11泛素化降解的E3连接酶和负责其去泛素化稳定的DUB；2）揭示这对E3-DUB如何响应环境胱氨酸水平变化来协同调控SLC7A11的稳定性；3）阐明该调控轴对癌细胞胱氨酸摄取、铁死亡敏感性的生物学影响；4）探索靶向该调控轴（如联合用药）在癌症治疗中的潜在应用价值。
详细研究流程与结果
第一部分：Neddylation-CRL3通路失活通过积累SLC7A11促进胱氨酸摄取 研究团队首先观察到，使用MLN4924（一种Neddylation修饰的抑制剂，可抑制Cullin-Ring连接酶(CRL)的活性）处理多种乳腺癌和肺癌细胞系后，培养上清中的胱氨酸水平下降，提示胱氨酸摄取增加。进一步检测发现，MLN4924能以时间和剂量依赖性的方式显著增加SLC7A11的蛋白质水平，而对另一亚基SLC3A2的影响较小且具有细胞系依赖性。使用另一种NAE抑制剂TAS4464得到了类似结果。MLN4924也轻度上调了SLC7A11的mRNA水平。敲低NAE的催化亚基NAEβ能重现SLC7A11的积累效应，表明这是MLN4924的靶点效应。功能上，敲低SLC7A11削弱了MLN4924诱导的胱氨酸摄取增加，证实了SLC7A11积累是胱氨酸摄取增加的原因。 为了确定SLC7A11是哪个CRL复合物的底物，研究团队逐一敲低了五种Cullin蛋白（Cul-1, -2, -3, -4A, -4B, -5）。结果显示，只有敲低Cul-3能导致多种癌细胞中SLC7A11的显著积累。使用特异性的Cul-3抑制剂DI-1859处理也得到了剂量依赖性的SLC7A11积累。免疫共沉淀实验证实SLC7A11特异地与Cul-3结合，而与其它Cullin蛋白不结合。最后，敲低Cul-3确实增加了胱氨酸的摄取。这些结果表明，SLC7A11是CRL3连接酶的一个新底物，CRL3失活导致的SLC7A11积累是胱氨酸摄取增加的原因。
第二部分：鉴定KCTD10为CRL3连接酶中识别SLC7A11的底物受体 CRL3通过其底物识别受体亚基来特异性结合底物。为了鉴定识别SLC7A11的受体，研究团队使用siRNA敲低了13个已知或推测具有肿瘤抑制功能的CRL3受体蛋白。结果显示，敲低KLHL13、KLHL25和KCTD10能增加SLC7A11水平。随后的免疫共沉淀实验发现，外源性表达的SLC7A11能与内源性的KLHL25和KCTD10结合，但不能与KLHL13结合。反向IP实验显示，外源性表达的KCTD10能与内源性SLC7A11结合，而KLHL25则不能。更重要的是，在生理条件下证实了内源性KCTD10与内源性SLC7A11的相互作用。 接下来，研究团队通过构建截短体确定了二者的结合域：SLC7A11通过其N端1-43个氨基酸与KCTD10结合，而KCTD10通过其C端结构域与SLC7A11结合。免疫荧光显示二者存在共定位。功能上，敲低KCTD10导致内源性SLC7A11蛋白水平积累，而过表达KCTD10则以剂量依赖的方式降低SLC7A11水平。KCTD10的敲低对SLC7A11的mRNA水平影响甚微。这些数据表明，CRL3^(KCTD10) 连接酶在翻译后水平负调控SLC7A11。
第三部分：证实CRL3^(KCTD10)是促进SLC7A11泛素化降解的E3连接酶 体内泛素化实验显示，过表达KCTD10（而非KLHL25）能显著促进外源性和内源性SLC7A11的多聚泛素化。进一步，只有野生型KCTD10，而非其不能结合底物（C端缺失）或不能结合Cul-3（BTB结构域缺失）的突变体，能促进SLC7A11的泛素化。体外泛素化实验在包含纯化的泛素、E1、E2和CRL3^(KCTD10) E3复合物的反应体系中，清晰地检测到了SLC7A11的泛素化。通过使用特定赖氨酸残基（K11或K48）保留或突变的泛素突变体进行实验，确认KCTD10介导的SLC7A11泛素化主要通过K48连接方式，这是典型的蛋白酶体降解信号。 蛋白质半衰期实验进一步证实了KCTD10对SLC7A11稳定性的调控：敲低KCTD10显著延长了SLC7A11的蛋白半衰期，而过表达KCTD10则缩短了其半衰期。KCTD10通过促进SLC7A11的K48连接多聚泛素化，导致其被蛋白酶体降解，从而发挥去稳定作用。因此，SLC7A11是CRL3^(KCTD10) E3连接酶的真正底物。
第四部分：鉴定USP18为稳定SLC7A11的去泛素化酶 为了找到稳定SLC7A11的DUB，研究团队筛选了一系列DUB，发现USP2、USP3、USP8、USP18和USP21能与内源性SLC7A11相互作用。进一步的去泛素化活性检测发现，只有USP18能显著降低SLC7A11的多聚泛素化水平。体外去泛素化实验中，纯化的USP18蛋白能有效移除SLC7A11上的泛素链。 研究团队验证了SLC7A11与USP18的相互作用：外源性SLC7A11与内源性USP18结合，内源性蛋白间也存在相互作用。通过构建USP18的系列缺失突变体，发现USP18的第51-150位氨基酸区域是其与SLC7A11结合所必需的；而SLC7A11则同样通过其N端1-43位氨基酸与USP18结合。免疫荧光显示二者存在共定位。 功能上，野生型USP18能有效去除SLC7A11的泛素链，而其酶活死亡突变体(C64S)或缺失SLC7A11结合域(151-372)的突变体则不能。敲低USP18显著降低了多种癌细胞中SLC7A11的蛋白质水平，但对mRNA水平影响不大；而过表达USP18则以剂量依赖的方式增加SLC7A11水平。蛋白质半衰期实验显示，敲低USP18缩短了SLC7A11的半衰期，而过表达则延长了其半衰期。利用CRISPR-Cas9技术敲除USP18的细胞系进一步证实了上述结果：USP18缺失导致SLC7A11水平下降、半衰期缩短、多聚泛素化水平升高。综上，USP18是一个通过去泛素化稳定SLC7A11的DUB。
第五部分：环境胱氨酸水平协调调控KCTD10-USP18轴及SLC7A11稳定性 研究团队探究了在何种生理条件下该E3-DUB对协调调控SLC7A11。他们发现，在谷氨酰胺或葡萄糖剥夺的应激条件下，SLC7A11和USP18水平会上调，但KCTD10水平不受影响。当聚焦于胱氨酸调控时，发现了极其显著的协调变化：完全剥夺胱氨酸会导致SLC7A11和USP18的蛋白质水平随时间推移而增加，同时KCTD10水平则下降。反之，培养基中胱氨酸浓度与SLC7A11和USP18水平呈负相关，与KCTD10水平呈正相关。当重新补充胱氨酸后，这些变化可以被逆转。 重要的是，之前报道过的其他SLC7A11 E3（如TRIM26、SOCS2、ZRANB1）或DUB（如OTUB1、DUBA）均不受胱氨酸剥夺的调控，突出了KCTD10-USP18轴在响应胱氨酸水平变化时的特异性。机制上，胱氨酸剥夺削弱了SLC7A11与KCTD10的相互作用，抑制了KCTD10介导的SLC7A11泛素化；同时，增强了SLC7A11与USP18的相互作用，促进了USP18介导的SLC7A11去泛素化。在胱氨酸剥夺条件下，过表达KCTD10或敲低USP18都会延迟SLC7A11的积累过程。这些结果表明，SLC7A11、KCTD10和USP18三者的水平和相互作用受环境胱氨酸水平的协调调控，以确保在胱氨酸匮乏时最大化SLC7A11的稳定性和功能，促进胱氨酸摄取。
第六部分：KCTD10-USP18轴通过靶向SLC7A11调控细胞存活与铁死亡 生物学功能实验表明，无论在胱氨酸充足还是匮乏条件下，敲低促进SLC7A11降解的KCTD10能促进细胞活力和克隆形成，表现出类似过表达SLC7A11的促存活效应；而敲低SLC7A11则抑制存活。共敲低SLC7A11和KCTD10仍抑制存活，说明SLC7A11起主导作用。相反，敲低稳定SLC7A11的USP18会抑制细胞活力，而这种抑制可被外源表达SLC7A11所挽救，表明USP18的促存活作用是通过上调SLC7A11实现的。 鉴于SLC7A11是铁死亡的关键调控因子，研究团队深入探讨了该轴对铁死亡的调控。敲低KCTD10促进了胱氨酸摄取。在诱导铁死亡的三种条件下（胱氨酸剥夺、GPX4抑制剂RSL3处理、SLC7A11抑制剂Erastin处理），敲低KCTD10均能显著挽救细胞活力，而这种挽救作用可被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 (Fer-1)阻断，证实了KCTD10调控的是铁死亡。更重要的是，KCTD10敲低对铁死亡的抑制作用在很大程度上可被同时敲低SLC7A11所抵消。这些结果证明，KCTD10通过靶向降解SLC7A11来促进铁死亡。 另一方面，敲低USP18减少了胱氨酸摄取，并显著增加了细胞对上述三种铁死亡诱导条件的敏感性，Fer-1可以逆转这种敏感性。过表达SLC7A11可以挽救由USP18敲低增强的Erastin诱导的铁死亡。这些结果证明，USP18通过稳定SLC7A11来抑制铁死亡。
第七部分：人类乳腺癌组织中的相关性分析与联合治疗策略 对TCGA数据库的分析显示，与正常组织相比，包括乳腺癌在内的多种癌症中SLC7A11和USP18的mRNA表达上调，而KCTD10的表达下调。对乳腺癌组织的免疫组化染色显示，在肿瘤组织和癌旁正常组织中，SLC7A11水平与USP18水平呈正相关，与KCTD10水平呈负相关。在一个包含142例肿瘤和58例癌旁的乳腺癌组织芯片中，肿瘤组织具有显著更高的SLC7A11和USP18蛋白水平，以及更低的KCTD10水平。绝大多数低KCTD10的病例伴有高SLC7A11，绝大多数高USP18的病例也伴有高SLC7A11。此外，靶向代谢组学分析发现，在同一患者的配对样本中，癌组织中的胱氨酸水平显著低于正常组织。这些临床数据高度支持了细胞模型中的发现，并表明在肿瘤微环境胱氨酸相对匮乏的情况下，低KCTD10和高USP18共同导致SLC7A11高表达，以驱动胱氨酸的快速摄取和消耗，满足肿瘤细胞的代谢需求。 基于MLN4924通过抑制CRL3积累SLC7A11、进而可能支持癌细胞存活的发现，研究团队提出了联合治疗策略：同时抑制Neddylation（MLN4924）和SLC7A11（Erastin或其衍生物IKE）。体外实验证实，Erastin能增强MLN4924对乳腺癌细胞活力的抑制。在MDA-MB-231细胞异种移植瘤模型中，MLN4924或IKE单药均能抑制肿瘤生长，而两者联合使用产生了最强的抑瘤效果，表现为肿瘤生长速率、体积和重量的显著下降。遗传学实验进一步支持了这一策略：敲低KCTD10（模拟MLN4924对SLC7A11的部分效应）的肿瘤对IKE的敏感性降低（抵抗性增强），而敲除USP18的肿瘤对IKE的敏感性增加。这为联合靶向Neddylation-CRL3通路和SLC7A11提供了有力的概念验证。
结论与意义 本研究的结论是：SLC7A11的稳定性受到CRL3^(KCTD10) E3连接酶（负调控）和USP18去泛素化酶（正调控）的协同调控。这一对E3-DUB构成了一个响应环境胱氨酸水平变化的精密调控轴。在胱氨酸匮乏时，KCTD10水平下降且与SLC7A11解离，USP18水平上升且与SLC7A11结合增强，共同导致SLC7A11蛋白积累，从而增强胱氨酸摄取、抑制铁死亡，促进癌细胞在营养压力下的存活。在人类乳腺癌中，这种调控模式与肿瘤的低胱氨酸微环境和SLC7A11高表达相关。基于此机制，联合应用Neddylation抑制剂（MLN4924）和SLC7A11抑制剂（IKE）能产生显著的协同抗肿瘤效应。 本研究的科学价值在于：首次系统地鉴定并阐明了在响应胱氨酸水平变化时，精细调控SLC7A11蛋白质稳定性的特异性E3-DUB分子对（KCTD10-USP18）及其工作机制，深化了对铁死亡上游调控网络的理解。其应用价值在于：揭示了癌细胞通过动态调节SLC7A11稳定性来适应胱氨酸微环境、逃避铁死亡的生存策略，并为克服由SLC7A11上调导致的治疗抵抗提供了新的联合治疗思路（MLN4924 + SLC7A11抑制剂），具有明确的转化医学前景。
研究亮点 1. 机制新颖性： 首次揭示了CRL3^(KCTD10)-USP18这一对E3-DUB作为响应胱氨酸信号的协调调控轴，精细控制SLC7A11的泛素化-去泛素化平衡。 2. 生理/病理相关性： 将分子机制与明确的生理信号（胱氨酸浓度）和病理特征（肿瘤低胱氨酸微环境）紧密联系，阐明了该调控轴在癌细胞适应代谢压力中的关键作用。 3. 研究系统性： 从表型（胱氨酸摄取）出发，通过药理学和遗传学手段逐步锁定关键通路（Neddylation-CRL3）、鉴定E3（KCTD10）和DUB（USP18），深入阐明了结合域、泛素链类型、蛋白半衰期变化等生化机制，并延伸到细胞功能（铁死亡）、临床相关性（组织芯片、代谢组）和治疗探索（联合用药），构成了一个完整、逻辑严密的研究链条。 4. 转化潜力明确： 提出的“MLN4924 + SLC7A11抑制剂”联合治疗方案在体外和体内模型中均得到验证，为针对SLC7A11高表达肿瘤的治疗提供了新的、有理论依据的联合策略。
其他有价值的发现 本研究还侧面印证了Neddylation-CRL通路在癌细胞代谢重编程中的广泛作用（此前该团队报道过其对线粒体功能和谷氨酰胺代谢的调控），进一步巩固了该通路作为癌症治疗靶点的重要性。此外，研究明确区分了KCTD10-USP18轴与之前报道的其他SLC7A11 E3/DUB在响应信号上的差异性，突出了不同调控机制可能作用于不同的生理病理背景。