学术研究报告：小鼠下丘脑神经递质及其代谢物的高效液相色谱-高分辨质谱分析方法优化
第一作者及机构
本研究的通讯作者为Shu-Ying Liu（刘淑莹），来自长春中医药大学吉林人参科学研究院（Jilin Ginseng Academy, Changchun University of Chinese Medicine）和中国科学院长春应用化学研究所（Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences）。合作作者包括Yang-Long Yang（杨阳龙）、Hui Li（李辉）、Bing Wang（王冰）。研究发表于2016年的*Journal of Chromatography B*（期刊编号1012-1013，页码79–88）。
学术背景与研究目标
神经递质（Neurotransmitters, NTs）及其代谢物在中枢神经系统中扮演关键角色，其平衡失调与精神分裂症、抑郁症、阿尔茨海默病和帕金森病等疾病密切相关。然而，生物样本中NTs的检测面临基质干扰复杂、化学稳定性差和浓度低等挑战。传统方法如高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳（CE）联用荧光或电化学检测器灵敏度不足，而三重四极杆质谱（LC-MS/MS）虽常用但分辨率有限。
本研究旨在开发一种基于Q Exactive混合四极杆-轨道阱高分辨质谱（HPLC-HRMS）的新方法，实现对小鼠下丘脑中10种NTs及其代谢物的快速、高灵敏度定量分析。该方法首次将Q Exactive MS技术应用于NTs的定量检测，并优化了衍生化步骤以提高稳定性。
实验流程与方法
样本制备
- 研究对象：10只雄性昆明小鼠（体重18–22 g），取其下丘脑组织，于-80°C保存。
- 提取与衍生化：组织经甲醇-乙腈（1:1）匀浆后离心，上清液蒸发干燥，残留物与衍生化试剂丹磺酰氯（Dansyl Chloride, DNS-Cl）在pH 9.5缓冲液中60°C反应10分钟，随后加入三乙胺继续反应40分钟，最后用甲酸中和。衍生化产物通过离心纯化，上清液用于分析。
色谱与质谱条件
- 色谱柱：反相Acucore C18（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm）。
- 流动相：0.1%甲酸水溶液与甲醇梯度洗脱，总运行时间18分钟。
- 质谱参数：正离子模式，分辨率70,000，毛细管温度350°C，喷雾电压3.5 kV。采用目标MS2模式（Targeted MS2）定量，通过碰撞诱导解离（CID）生成特征碎片离子（如m/z 383.1058为去甲肾上腺素衍生物的特征离子）。
方法验证
- 线性范围与灵敏度：校准曲线覆盖0.0008–25.0 nmol/mL，检出限（LOD）为0.0008–0.05 nmol/mL，定量限（LOQ）为0.002–25.0 nmol/mL。
- 精密度与准确度：日内和日间相对标准偏差（RSD）为0.36–12.70%，回收率81.83–118.04%。
- 稳定性：衍生化样本在室温4小时和-80°C保存30天内稳定性良好。
主要结果
方法性能
- 高分辨率优势：Q Exactive MS的70,000分辨率显著降低基质干扰，目标MS2模式通过二次离子筛选提高特异性（表1显示MS2模式的RSD优于全扫描和SIM模式）。
- 快速分析：10种化合物在18分钟内完成分离，较传统LC-MS/MS方法效率提升。
下丘脑NTs浓度
- 检测结果显示，GABA和L-酪氨酸（L-AA）浓度最高（分别为50.6×10² nmol/g和60.57 nmol/g），而高香草酸（HVA）和肾上腺素（E）最低（0.58 nmol/g和0.25 nmol/g）（表5）。
衍生化机制
- DNS-Cl与伯胺、酚羟基反应生成稳定衍生物，但仲胺（如5-HT）因空间位阻未完全衍生化。通过优化pH和反应时间，实现了对多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）等的高效标记。
结论与意义
科学价值
- 首次将Q Exactive HRMS技术应用于NTs定量分析，为复杂生物样本的高分辨检测提供了新范式。
- 衍生化结合目标MS2模式显著提升灵敏度和抗干扰能力，LOD低至0.0008 nmol/mL。
应用潜力
- 可作为神经退行性疾病研究的工具，通过监测下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的NTs动态变化，揭示疾病机制。
- 方法的高通量和稳定性适合临床前药物筛选及疗效评估。
研究亮点
技术创新
- 开发了基于Q Exactive HRMS的靶向MS2定量方法，突破了传统三重四极杆质谱的分辨率限制。
- 优化DNS-Cl衍生化流程，解决了代谢物化学不稳定的问题。
跨学科意义
- 将高分辨质谱的定性优势拓展至定量领域，为代谢组学和神经化学研究提供新思路。
其他价值
本研究通过对比不同扫描模式（全扫描、SIM、MS2），明确了目标MS2在复杂基质中的优越性（表1），并为后续开发类似方法提供了参数优化模板。此外，下丘脑NTs的基础数据可为神经内分泌研究提供参考。