本研究由厦门大学医学院翔安医院乳腺甲状腺外科及肿瘤中心的陈蔚凌、张永渠、李荣辉（并列第一作者），以及汕头大学医学院附属肿瘤医院中心实验室的李耀辰和厦门大学医学院翔安医院的张国君（共同通讯作者）领导的团队完成。研究成果以题为 “Notch3 transactivates glycogen synthase kinase-3-beta and inhibits epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer cells” 的论文形式，于2022年9月14日发表于国际期刊 《Cells》（2022年卷11期，第2872页）。该期刊编辑为Jozsef Dudas和Tuula Kallunki，文章遵循知识共享署名（CC BY）许可协议开放获取。

学术背景与研究目的

本研究属于肿瘤生物学与分子癌症研究领域，聚焦于乳腺癌的进展与转移机制。乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，其死亡率居高不下的主要原因之一是癌细胞发生局部或远处转移。上皮-间质转化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition， EMT）是这一转移过程中的关键生物学事件。在EMT过程中，具有极性和强粘附性的上皮细胞获得间质细胞的特性，包括迁移和侵袭能力增强，这直接驱动了肿瘤的侵袭和转移。因此，深入阐明EMT的调控机制对于开发新的乳腺癌治疗策略和预后标志物具有重要意义。

Notch信号通路是一个在进化上高度保守的途径，参与调控细胞命运决定、增殖、分化和存活等多种生命过程。在哺乳动物中，Notch家族包括Notch1-4四个受体成员。有趣的是，它们在乳腺癌中扮演的角色不尽相同，甚至相反。例如，Notch1常作为癌基因促进肿瘤发展，而Notch2和Notch3则在某些背景下表现出肿瘤抑制功能。课题组前期的研究工作表明，Notch3在乳腺癌中能够通过转录上调雌激素受体α（ERα）和GATA3等分子来抑制EMT进程。

另一方面，糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3-beta， GSK3β）是Wnt信号通路中的关键激酶。大量证据表明，GSK3β通过下调锌指转录抑制因子Snail（后者可抑制上皮标志物E-cadherin的表达）来发挥EMT抑制因子的作用。此前的研究发现，GSK3β能与Notch1和Notch2的胞内结构域发生物理相互作用并对其进行磷酸化，但对Notch1是正向调控，对Notch2是负向调控。然而，Notch3与GSK3β在乳腺癌EMT中的相互关系尚未明确，两者之间是否存在“交叉对话”（Crosstalk）也缺乏广泛研究。

基于以上背景，本研究旨在探究Notch3是否作为GSK3β的转录激活因子在乳腺癌中发挥作用。具体科学问题包括：Notch3能否调控GSK3β的表达？这种调控是直接的还是间接的？Notch3通过GSK3β抑制EMT的分子机制是什么？Notch3与GSK3β在临床乳腺癌样本中的表达是否存在关联？两者的表达水平与患者预后有何关系？解答这些问题将有助于揭示Notch3抑制乳腺癌EMT的新机制，并为乳腺癌的预后评估提供潜在的生物标志物。

详细研究流程

本研究设计严谨，从生物信息学分析、体外细胞实验、分子机制探索到临床样本验证及预后分析，构成了一个完整的研究闭环。具体流程如下：

1. 生物信息学与初步表达关联分析：

   • 研究对象：利用公共数据库“乳腺癌基因表达挖掘器v4.7”（Breast cancer gene-expression miner v4.7）分析Notch家族成员与GSK3β在DNA水平的相关性。
   • 实验与方法：通过数据库检索和统计分析，计算Notch3与GSK3β表达的相关性系数。
   • 细胞模型验证：选取两种具有代表性的乳腺癌细胞系：MCF-7（腔面型，Notch3高表达）和MDA-MB-231（三阴性型，Notch3低表达）。通过蛋白质印迹（Western Blot）和实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测这两种细胞系中Notch3和GSK3β在蛋白和mRNA水平的表达情况。同时，采用免疫荧光染色技术在MCF-7和另一腔面型细胞系T-47D中观察Notch3与GSK3β的共定位情况。

2. Notch3对GSK3β表达及EMT表型的调控功能验证：

   • 研究对象：MCF-7和MDA-MB-231细胞系。
   • 实验与方法：
     • 功能缺失（Loss-of-function）实验：在MCF-7细胞中转染针对Notch3的小干扰RNA（siRNA），敲低Notch3的表达。
     • 功能获得（Gain-of-function）实验：在MDA-MB-231细胞中转染携带Notch3胞内结构域（N3ICD）的过表达质粒（pCMV-N3ICD），建立稳定过表达Notch3的细胞株。
   • 检测指标：分别通过qRT-PCR和Western Blot检测上述操作后GSK3β的mRNA和蛋白水平变化。同时，检测EMT关键标志物的变化：上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin。此外，还检测了β-连环蛋白（β-catenin）的总量及其磷酸化水平（Thr41/Ser37/Ser33），以评估Wnt/β-catenin通路的活性。

3. Notch3转录激活GSK3β的分子机制探索：

   • 研究对象：MCF-7和MDA-MB-231细胞的基因组DNA。
   • 实验与方法：
     • 启动子结合位点预测与染色质免疫共沉淀（ChIP）：首先，利用生物信息学工具在GSK3β基因启动子区预测CSL转录因子结合位点。随后，设计覆盖这些位点的引物，在MCF-7细胞中进行ChIP实验。使用Notch3抗体富集与Notch3结合的DNA片段，再通过PCR扩增和凝胶电泳验证Notch3是否特异性结合在GSK3β启动子的特定区域。
     • 双荧光素酶报告基因实验：为了直接证明Notch3对GSK3β启动子活性的调控，研究团队构建了一个包含GSK3β启动子特定区域（-354 bp至-268 bp，内含预测的CSL结合位点）的报告基因质粒（pGL3-GSK3β-enhancer）。将报告基因质粒与内参质粒共转染至细胞中，并在MCF-7细胞（敲低Notch3）和MDA-MB-231细胞（过表达N3ICD）中检测荧光素酶活性的变化，以反映启动子活性的增减。

4. Notch3通过GSK3β抑制细胞迁移和侵袭的功能挽救实验：

   • 研究对象：MCF-7和MDA-MB-231细胞。
   • 实验与方法：
     • 划痕愈合实验：在细胞单层上制造划痕，模拟细胞迁移过程。分别观察：MCF-7细胞在敲低Notch3、以及敲低Notch3同时过表达GSK3β后的愈合能力；MDA-MB-231细胞在过表达N3ICD、以及过表达N3ICD同时敲低GSK3β后的愈合能力。
     • Transwell迁移与侵袭实验：使用Transwell小室更定量地评估细胞迁移和侵袭能力。实验分组与划痕实验类似，通过计数穿过小室的细胞数来量化表型变化。

5. 临床样本验证与预后分析：

   • 研究对象：从汕头大学医学院附属肿瘤医院收集的68例乳腺癌手术标本。
   • 实验与方法：
     • 免疫组织化学（IHC）：对石蜡包埋的乳腺癌组织切片进行Notch3和GSK3β的免疫组化染色。根据阳性细胞百分比和染色强度计算组织学评分（H-score），并将样本分为高表达组和低表达组。通过卡方检验分析两者表达的相关性，并分析其与乳腺癌亚型等临床病理特征的关系。
   • 预后数据库分析：利用在线生存分析工具“Kaplan-Meier Plotter”，根据Notch3和GSK3β的mRNA表达水平，分析其与所有乳腺癌患者及各分子亚型（腔面A型、腔面B型、HER2过表达型、基底样型）患者无复发生存期（Relapse-Free Survival， RFS）的关系。

主要研究结果

1. Notch3与GSK3β表达正相关且富集于腔面型乳腺癌：数据库分析显示，Notch3与GSK3β的mRNA表达呈显著正相关（r=0.15, p<0.0001）。在细胞水平，MCF-7细胞（腔面型）中Notch3和GSK3β的蛋白及mRNA表达水平均显著高于MDA-MB-231细胞（三阴性型）。免疫荧光证实Notch3与GSK3β在MCF-7和T-47D细胞的细胞核和细胞质中共定位。这些结果初步提示两者可能存在共表达和功能关联。

2. Notch3正向调控GSK3β表达并抑制EMT：在MCF-7细胞中敲低Notch3，导致GSK3β的mRNA和蛋白水平显著下降，同时伴随E-cadherin下调、Vimentin上调以及β-catenin总蛋白增加（其磷酸化水平降低），表明EMT被诱导，Wnt通路活性增强。反之，在MDA-MB-231细胞中过表达N3ICD，则显著上调GSK3β表达，促进E-cadherin表达，抑制Vimentin表达，并增加β-catenin的磷酸化降解，从而抑制EMT表型。这些结果直接证明Notch3能够诱导GSK3β表达，并发挥EMT抑制作用。

3. Notch3直接结合并转录激活GSK3β启动子：ChIP实验结果显示，Notch3蛋白特异性结合在GSK3β启动子区-368 bp至-268 bp的区域，该区域包含一个CSL反义结合位点（TTCCCA）。双荧光素酶报告基因实验进一步证实：在MCF-7细胞中，随着Notch3 siRNA转染浓度的梯度增加，GSK3β启动子的荧光素酶活性呈剂量依赖性下降；而在MDA-MB-231细胞中，随着N3ICD过表达质粒浓度的增加，启动子活性呈剂量依赖性上升。这两项实验从结合和功能两个层面确凿地证明了Notch3是GSK3β的直接转录激活因子。

4. GSK3β介导了Notch3对细胞迁移和侵袭的抑制作用：功能挽救实验结果表明，Notch3的抑癌作用依赖于GSK3β。具体而言，在MCF-7细胞中，敲低Notch3显著增强了细胞的划痕愈合能力以及Transwell迁移和侵袭能力；而同时过表达GSK3β可以部分逆转这种促迁移/侵袭效应。相反，在MDA-MB-231细胞中，过表达N3ICD显著抑制了细胞的迁移和侵袭；而同时敲低GSK3β则能部分抵消这种抑制作用。这证明Notch3主要通过上调GSK3β来发挥其抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的功能。

5. 临床样本中Notch3与GSK3β表达正相关且预示良好预后：对68例临床乳腺癌组织的免疫组化分析显示，Notch3与GSK3β的蛋白表达呈显著正相关（r=0.416, p=0.001），且两者在腔面型乳腺癌中的表达显著高于其他亚型（p=0.037）。Kaplan-Meier生存分析显示，在所有乳腺癌患者中，Notch3高表达或GSK3β高表达的患者，其无复发生存期（RFS）均显著优于低表达患者。进一步分析发现，在腔面A型、腔面B型和HER2过表达型乳腺癌中，Notch3或GSK3β高表达均与更好的RFS相关，但在基底样型中无此关联。更重要的是，Notch3与GSK3β同时高表达的患者，其RFS在所有患者组和腔面A型亚组中均为最佳。这为Notch3/GSK3β轴作为乳腺癌预后生物标志物提供了有力的临床证据。

研究结论与价值

本研究得出结论：Notch3通过直接结合GSK3β基因启动子上的CSL结合位点，转录上调GSK3β的表达，进而抑制乳腺癌细胞的上皮-间质转化（EMT）进程、迁移和侵袭能力。Notch3/GSK3β信号轴在临床乳腺癌样本中功能活跃，两者的高表达与更好的患者预后相关，尤其是在腔面型乳腺癌中。

本研究的科学价值在于： 1. 揭示了Notch3抑制EMT的新机制：首次阐明了Notch3通过直接转录激活GSK3β来抑制乳腺癌EMT，丰富了Notch3作为肿瘤抑制因子的功能图谱，并为Notch信号通路与Wnt/GSK3β通路之间的“交叉对话”提供了新的连接点。 2. 明确了Notch3作用的直接下游靶点：将GSK3β确定为Notch3的直接转录靶标，解决了Notch3如何精确调控下游基因以抑制EMT的关键问题。 3. 提供了潜在的预后生物标志物：研究证实Notch3和GSK3β的表达水平，特别是两者共高表达的状态，与乳腺癌（尤其是腔面型）患者的良好预后显著相关。这为临床分层管理和预后判断提供了新的分子指标。 4. 提示了潜在的治疗靶点：Notch3/GSK3β轴作为一个抑制肿瘤转移的信号通路，其激活可能成为未来治疗乳腺癌（特别是腔面型乳腺癌）转移的新策略。针对该通路的设计药物或基因治疗具有探索价值。

研究亮点

1. 研究逻辑完整，层层递进：从生物信息学线索到细胞模型验证，从分子机制探索（ChIP、报告基因）到功能挽救实验，再到临床样本关联与预后分析，构成了一个非常坚实和完整的证据链。
2. 机制研究深入：不仅证明了Notch3调控GSK3β，更重要的是通过ChIP和双荧光素酶报告基因实验，直接证实了Notch3作为转录因子对GSK3β启动子的结合与激活作用，将调控关系定位到了最直接的转录水平。
3. 临床转化意义明确：将基础研究发现与临床病理特征和患者生存数据紧密结合，使研究成果超越了细胞和分子层面，具备了明确的临床相关性和转化医学潜力。
4. 关注乳腺癌异质性：研究特别关注了不同分子亚型（腔面型 vs. 三阴性）中Notch3/GSK3β轴的差异，并在预后分析中进行了亚组分析，使结论更加精确和有针对性。

其他有价值内容

本研究的讨论部分还对Notch家族其他成员（Notch1， Notch2， Notch4）在乳腺癌中复杂且有时相反的功能进行了回顾和比较，突出了Notch3功能的独特性。此外，研究还提及了课题组前期的系列工作（Notch3通过ERα、GATA3、KIBRA等分子抑制EMT），将本次关于GSK3β的发现置于一个更广阔的Notch3抑制性调控网络中，展示了该团队在这一方向的持续深耕和系统性成果。文章提供的补充材料（包括抗体、引物、siRNA序列、质粒图谱验证、额外生存分析图等）也非常详尽，增强了研究的可重复性和透明度。