《Nature Communications》2025年发表研究报道：H3.3K27M突变型弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）中，癌组蛋白（oncohistone）驱动的H3.3K27M/CREB5/ID1轴维持肿瘤干性及恶性进展
一、研究作者、机构与发表信息
本研究题为“An oncohistone-driven H3.3K27M/CREB5/ID1 axis maintains the stemness and malignancy of diffuse intrinsic pontine glioma”，发表于《Nature Communications》（2025年16卷，文章编号3675），DOI为10.1038/s41467-025-58795-2。主要作者为Wei Zhou与Cheng Xu（并列第一作者），通讯作者为Liwei Zhang（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科）和Qiaoran Xi（清华大学生命科学学院，蛋白质科学教育部重点实验室）。研究团队来自清华大学、首都医科大学、上海交通大学医学院等多个机构。
二、研究背景与科学问题
弥漫性内生性脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）是一种主要发生于儿童的弥漫性中线胶质瘤（diffuse midline glioma，DMG）亚型，中位生存期仅约10个月。约80%的DIPG携带组蛋白H3第27位赖氨酸突变为甲硫氨酸（H3K27M），其中约60%为H3.3K27M，约20%为H3.1K27M。H3K27M被称为癌组蛋白，其核心致病机制在于抑制多梳抑制复合物2（PRC2）将H3K27二甲基化转化为三甲基化的酶活性，从而阻碍抑制性标记H3K27me3向邻近核小体的横向扩散，导致异常基因表达。DIPG细胞停滞在类似少突胶质前体细胞（OPC-like）的干性状态，只有OPC样肿瘤细胞能在小鼠中形成移植瘤。
ID（DNA结合抑制因子）蛋白通过隔离分化相关转录因子抑制分化并维持干性。ID1是BMP信号通路的下游靶点，在H3.1K27M突变且ACVR1突变的DIPG中因BMP信号高活性而高表达。然而H3.3K27M型DIPG的BMP信号活性低，ID1却仍高表达，其调控机制尚不明确。CREB5属于CREB转录因子家族，缺乏PKA调控的磷酸化位点，因此不响应cAMP/PKA信号。尽管CREB5在多种癌症中高表达，其作为致癌转录因子的机制仍未阐明。本研究旨在揭示H3.3K27M突变如何在不依赖BMP信号的情况下驱动ID1表达，以及该轴在DIPG干性维持与恶性进展中的作用。
三、研究流程与实验方法
研究流程可分为多个递进的实验模块，每个模块均包含特定的研究对象、样本量与实验操作。
模块一：验证ID1在H3K27M DIPG中的致癌作用。 研究团队首先通过免疫组化（IHC）检测H3.3K27M突变DIPG患者肿瘤组织与非DIPG患者脑桥组织中ID1阳性细胞数；随后利用免疫印迹（immunoblotting）比较三株DIPG患者来源细胞系（H3.3K27M的DIPG17与TT150630，以及H3.1K27M/ACVR1突变的DIPG-IV）与脑桥前体细胞（PPCs）中ID1蛋白水平。为评估ID1功能，在DIPG17和TT150630细胞中构建ID1敲低（knockdown，KD）稳定株，进行细胞增殖实验、实时定量PCR（qPCR）检测干性标志物SOX2和OLIG2，并通过立体定位注射建立两种原位异种移植模型（每组5-6只小鼠），监测肿瘤生物发光与生存期。此外，还通过腺相关病毒（AAV）递送shRNA靶向ID1进行治疗性验证。
模块二：筛选H3.3K27M DIPG中调控ID1的上游转录因子。 研究者利用SCENIC分析公共DIPG单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，鉴定出23个在OPC样细胞中异常高表达的转录因子。先排除11个受ID1调控的候选因子（通过ID1敲低后qPCR验证），再在DIPG17细胞中对剩余12个进行小规模shRNA筛选，发现敲低CREB5、HDAC2、FOXP1、ETV1和BCLAF1中的5个能显著降低ID1表达。通过Kaplan-Meier分析两个临床队列，发现仅CREB5和FOXP1高表达与更差预后相关。进一步利用ID1启动子双荧光素酶报告系统检测CREB5和FOXP1的直接转录调控作用。
模块三：验证CREB5的干性维持与促癌功能。 对DIPG17和TT150630细胞进行CREB5敲低，通过细胞活力、神经球形成、极限稀释实验、流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）和免疫荧光（OLIG2、TUBB3、GFAP）评估增殖、干性、凋亡和分化。构建CREB5敲低原位异种移植模型和AAV介导的shRNA治疗模型，分析肿瘤体积、生存期及组织学指标。
模块四：探究CREB5在正常脑发育中的表达模式及其被H3.3K27M诱导的机制。 利用ENCODE数据库中小鼠胚胎不同发育阶段各脑区的RNA-seq和ChIP-seq数据，分析Creb5的时空表达及H3K27me3/H3K27ac修饰；利用空间分辨单细胞多组学数据和免疫荧光验证。引入H3.3K27M至小鼠后脑前体细胞，通过qPCR和免疫印迹检测Creb5和Id1表达。在人PPC细胞中过表达H3.3K27M或H3.1K27M，结合CUT&Tag技术检测H3K27M、H3K27me3和H3K27ac的基因组分布；在DIPG17细胞中敲低H3.3K27M验证对CREB5表达及H3K27me3在CREB5位点富集的影响。
模块五：解析CREB5的转录调控网络及其与SWI/SNF复合物的协作。 对DIPG17细胞进行CREB5 CUT&Tag、CUT&RUN、ATAC-seq及多种组蛋白修饰的CUT&Tag，分析CREB5全基因组结合模式。免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定CREB5互作蛋白。通过CREB5敲低前后BRG1 CUT&RUN和ATAC-seq的比较分析，评估CREB5对SWI/SNF复合物染色质结合和染色质可及性的影响。
模块六：靶向CREB5超级增强子的药物筛选与组合治疗验证。 首先分析JQ1处理DIPG细胞的时间序列ChIP-seq数据，观察BRD4和H3K27ac在CREB5超级增强子区域的富集。利用MCE生物活性化合物库筛选BRD4抑制剂，通过qPCR检测CREB5表达、细胞活力检测对DIPG17和PPC细胞的作用，确定ABBV-075为候选药物。用分子对接预测ABBV-075与BRD4的结合模式。构建CREB5超级增强子和典型增强子的双荧光素酶报告系统检测ABBV-075对增强子活性的抑制。对ABBV-075处理的DIPG17进行RNA-seq和ATAC-seq。最后在TT150630异种移植模型（每组5只）中评估ABBV-075单药疗效，并在DIPG17和TT150714细胞中通过组合指数和Bliss独立模型评估ABBV-075与BRG1抑制剂BRM014的协同效应。
四、主要研究结果
ID1在H3.3K27M DIPG中高表达且具有致癌作用。 IHC显示H3.3K27M DIPG肿瘤中ID1阳性细胞数显著高于非DIPG脑桥组织；免疫印迹证实三株DIPG细胞中ID1蛋白水平显著高于PPC。ID1敲低后细胞增殖显著降低，SOX2和OLIG2表达下调。在两种异种移植模型中，ID1敲低组的肿瘤体积显著小于对照组，生存期显著延长。AAV递送shID1也抑制肿瘤生长并延长生存。肿瘤组织免疫荧光显示ID1敲低后OLIG2明显减少，GFAP和TUBB3显著增加，表明干性下降、分化增强。
CREB5在H3.3K27M DIPG中独立于BMP信号调控ID1。 在DIPG-IV（H3.1K27M/ACVR1突变）细胞中，BMP信号抑制剂LDN193189可在8小时内显著抑制ID1表达；而在TT150630和DIPG17（H3.3K27M/ACVR1野生型）中，LDN193189处理不影响ID1水平。SCENIC分析和shRNA筛选鉴定出CREB5等5个调控ID1的转录因子。双荧光素酶实验证实CREB5而非FOXP1可直接激活ID1启动子。CREB5过表达可部分恢复CREB5敲低细胞中ID1的表达。临床儿科脑肿瘤图谱（CBTTC）中ID1与CREB5表达呈正相关（r = 0.18）。
CREB5维持H3.3K27M DIPG的OPC样干性状态并促进肿瘤生长。 qPCR和公共RNA-seq数据表明CREB5在H3.3K27M DIPG中显著高表达，且与更差预后相关。CREB5敲低显著抑制DIPG17和TT150630的细胞活力与神经球形成，极限稀释实验显示干性频率显著下降，流式细胞术显示凋亡比例增加，免疫荧光显示OLIG2减少、TUBB3增加。体内模型中，CREB5敲低或AAV-shCREB5治疗均显著减小肿瘤体积并延长小鼠生存期，组织学分析显示肿瘤细胞核数、人核抗原和Ki67显著减少，分化标志物增加。
CREB5在正常前脑前体细胞特异表达，H3.3K27M在后脑诱导其表达。 ENCODE数据表明Creb5在小鼠胚胎E10.5至E16.5的前脑特异性表达，而后脑和中脑无表达；前脑Creb5启动子区有高H3K27ac且无H3K27me3，而后脑和中脑则相反。空间单细胞多组学和免疫荧光显示Creb5富集于前脑背侧室管膜区（VZ）的晚期放射状胶质细胞。Hoxa簇4C-seq显示后脑前体细胞中Hoxa簇与Creb5上游-77 kb区域存在显著相互作用，与后脑中Creb5位点H3K27me3富集相关。引入H3.3K27M后，小鼠后脑前体细胞中Creb5表达上调1.6倍，且H3K27me3在Creb5位点及邻近Hoxa簇显著降低。在人PPC细胞中过表达H3.3K27M（而非H3.1K27M或野生型H3.3/H3.1）可诱导CREB5表达。CUT&Tag显示H3.3K27M富集于CREB5启动子和基因间区，而H3K27me3几乎不可检测（log2 fold change = -2.6）。在DIPG17中敲低H3.3K27M导致CREB5表达下降，且CREB5启动子处H3K27me3显著回升。
CREB5与SWI/SNF复合物协作驱动致癌转录。 CREB5 CUT&Tag鉴定出5205个结合峰，主要位于活性启动子和增强子区域。IP-MS发现CREB5与AP-1家族（JUN、JUND、JUNB）、ATF家族（ATF2、ATF7）及SWI/SNF复合物多个亚基（SMARCA4/BRG1、SMARCD3、SMARCAL1、SMARCB1、ARID1A、ARID1B）互作。78%的CREB5结合峰有BRG1结合。CREB5敲低导致BRG1染色质结合和ATAC-seq信号在共结合区域显著下降，且这些区域的染色质可及性变化与BRG1敲除后的基因表达变化正相关（r = 0.12，p = 0.023）。
ABBV-075通过破坏CREB5超级增强子抑制DIPG。 药物筛选发现ABBV-075显著抑制CREB5表达和DIPG17增殖，对PPC毒性小，IC50低于JQ1。分子对接显示ABBV-075与BRD4的WPF shelf区域结合。双荧光素酶报告系统证实ABBV-075在20 nM即可最大程度抑制CREB5超级增强子活性。ATAC-seq显示ABBV-075处理后，87.17%的超级增强子相关ATAC-seq峰显著降低，CREB5是排名第12的受影响基因（log2 fold change = -1.41）。RNA-seq和GO分析表明ABBV-075下调干性基因（PROM1、OLIG2、PDGFRA）并上调分化基因（TUBB3、SEMA3C、SYN1）。体内实验中ABBV-075（1 mg/kg，口服，每3天一次，共8次）显著抑制TT150630移植瘤生长并延长生存。组合治疗分析显示ABBV-075与BRM014在DIPG17和TT150714细胞中具有协同抑制作用（Bliss评分分别为12.04和16.01）。
五、研究结论与意义
本研究揭示了一条由癌组蛋白H3.3K27M驱动的CREB5/ID1致癌轴。在H3.3K27M DIPG中，H3.3K27M通过重塑CREB5位点的H3K27me3景观（尤其是超级增强子区域）直接激活CREB5表达；CREB5作为转录因子直接驱动ID1转录，不依赖BMP信号，从而维持DIPG细胞的OPC样干性状态并促进恶性进展。CREB5与SWI/SNF染色质重塑复合物（特别是催化亚基BRG1）协作调控致癌转录程序。靶向CREB5超级增强子的BRD4抑制剂ABBV-075可显著降低CREB5表达并抑制H3.3K27M DIPG肿瘤生长；ABBV-075与BRG1抑制剂联合使用展现出协同治疗效果。该研究为H3.3K27M突变型DIPG提供了从表观遗传机制到临床转化策略的系统性证据。
六、研究亮点
七、其他重要内容
研究还发现CREB5存在一个短异构体，在临床儿童脑肿瘤中存在，但该短异构体在预后预测和ID1调控方面与全长异构体无差异。此外，CREB5结合区域中存在H3K9me2（兼性异染色质标记）的共定位现象，提示CREB5可能在兼性异染色质区域也发挥与启动子区域不同的功能。这些观察为后续研究提供了潜在方向。