血脑屏障（Blood–Brain Barrier, BBB）是分隔中枢神经系统与外周循环的高度选择性界面，对于维持脑内稳态至关重要。由于人类与常用啮齿动物在脑血管结构和组成上存在差异，动物模型往往无法完全复制人类疾病。因此，利用人类细胞的体外模型成为连接人类与动物研究的重要桥梁。然而，传统的二维（2D）Transwell模型虽然应用广泛，但其平坦的结构缺乏血流剪切力的影响，而剪切力在血管内皮细胞对各种刺激的响应、循环细胞粘附及跨内皮迁移中起关键作用。现有的三维BBB模型虽然在结构上更接近真实微血管，但普遍存在制造工艺复杂、需要洁净室或高成本设备等不足，限制了其广泛应用。
基于上述背景，本研究的主要目的是开发一种简单、易组装且成本效益高的三维微通道BBB模型，其具有圆形截面和约100微米的直径，能够模拟真实微血管中的流动和剪切力分布，特别是脑部毛细血管后微静脉的生理条件。
该研究由Yunfei Li和Bingmei M. Fu共同完成，他们来自纽约城市大学城市学院生物医学工程系（Department of Biomedical Engineering, The City College of the City University of New York）。本论文发表于 Cells 期刊，于2025年3月19日在线发表。
本研究采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）、胶原水凝胶和人脑微血管内皮细胞系（HCMEC/D3）构建三维BBB模型。整个实验流程主要包括模型构建、BBB生成、硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate, HS）定量、通透性测量和肿瘤细胞粘附实验五个核心环节。
1. 三维PDMS–水凝胶微通道的构建
研究者首先将PDMS预聚物与固化剂按10：1质量比混合，去除气泡后倒在洁净的玻璃盖玻片上，并在其中放置一根直径约120微米的针灸针。针在使用前需用1% BSA/PBS混合物在4°C下包被过夜，以防止PDMS与针粘连。PDMS在100°C烘箱中固化35分钟后拔出针，形成基础微通道。随后，在PDMS基底中部切去一段约3×3毫米的区域，重新插入针，并向该切除段内注入浓度约5毫克/毫升的中和型I型胶原蛋白（含1毫摩尔京尼平作为交联剂以稳定水凝胶）。在37°C孵育过夜后拔出针，即在胶原部分形成微通道。通过18号管适配器在PDMS上打孔形成入口，连接PE-50管，由注射泵驱动灌注。该模型的关键参数为：微通道直径约100微米，通道距离盖玻片约5微米。所用4–5毫克/毫升的胶原蛋白弹性模量与小鼠海马体相似，并可防止细胞渗入凝胶。
2. 流动条件下三维微通道BBB的生成
将HCMEC制备成400–500万细胞/毫升的悬液，加入8%右旋糖酐-70k以增加介质粘度并促进血管稳定性。细胞悬液通过入口缓慢灌注入微通道，在显微镜下确认细胞贴附后，将装置放入培养箱，每15分钟翻转一次以确保细胞在通道表面均匀分布。孵育1小时后更换新鲜培养基，并在接种后6小时开始以1.0–1.3微升/分钟的流速持续灌注。该流速可在直径约100微米的圆形通道内产生1–3达因/平方厘米的壁面剪切力，与脑微循环毛细血管后微静脉的生理条件一致。BBB在流动条件下培养4–5天后形成。
3. HS的免疫荧光定量
为验证三维微通道BBB成功生成糖萼（Glycocalyx）中的HS，并定量检测多种调节剂的作用，研究者对微通道BBB进行FITC–抗HS免疫染色。具体步骤包括：1% BSA/PBS冲洗、2%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定20分钟、0.1% NaBH₄处理7分钟、2%正常山羊血清封闭30分钟，然后用FITC偶联抗体（1：100）在4°C下孵育约2.5小时。使用Zeiss LSM 800共聚焦激光扫描显微镜以20×/NA0.8物镜采集z-stack图像，利用NIH ImageJ进行投影和强度定量。
4. 溶质通透性测量
采用荧光示踪剂法测量微通道BBB对小分子荧光素钠（NaFl，分子量376）和大分子FITC–葡聚糖-70k（Dex-70k，分子量70 kDa）的通透性。将5微摩尔/升NaFl或50微摩尔/升FITC–Dex-70k的1% BSA–林格液以约1.5微升/分钟灌注入微通道，同时用Nikon TE2000-S成像系统以20×/NA0.75物镜每0.25–0.5秒采集一帧图像。根据公式P = (1/ΔI₀) × (dI/dt)₀ × r/2计算通透性，其中ΔI₀为示踪剂刚充满管腔时的荧光强度， (dI/dt)₀为初始灌注阶段强度随时间变化的斜率，r为微通道半径。
5. HS调节及肿瘤细胞粘附实验
为检验HS调节对BBB功能和肿瘤细胞粘附的影响，研究者使用了三种调节剂：50毫单位/毫升肝素酶III（Heparinase III）处理2小时以降解HS；1纳摩尔VEGF处理2小时；以及0.1毫克/毫升血清类粘蛋白（Orosomucoid）处理1小时以增强HS。对于粘附实验，MDA-MB-231（MB231）乳腺癌细胞先用10微摩尔CellTracker Red标记30分钟，经40微米细胞过滤器过滤，然后以约100万细胞/毫升浓度在1% BSA–林格液中以1–1.3微升/分钟流速灌注1小时。在Nikon Eclipse TE2000-S显微镜下计数粘附细胞。
1. 三维BBB与二维BBB及大鼠在体脑微血管的通透性比较
结果显示，三维微通道BBB对NaFl的通透性（P_NaFl）为2.09 ± 0.75 × 10⁻⁶厘米/秒，与大鼠脑微血管的2.00 ± 0.76 × 10⁻⁶厘米/秒无显著差异，但显著低于二维Transwell BBB的3.37 ± 0.44 × 10⁻⁶厘米/秒。同样，三维BBB对Dex-70k的通透性（P_Dex-70k）为1.94 ± 0.53 × 10⁻⁷厘米/秒，与大鼠脑微血管的1.46 ± 0.35 × 10⁻⁷厘米/秒无显著差异，但显著低于二维BBB的2.56 ± 0.38 × 10⁻⁷厘米/秒。这表明流动条件在生成体内类似BBB中起关键作用。
2. 调节剂对三维BBB中HS含量的影响
在流动条件下，肝素酶III和VEGF分别将三维微通道BBB中的HS含量降至对照的34.3 ± 4%和40.6 ± 7%。这一结果与二维BBB中肝素酶III和VEGF的效应（分别为63 ± 8%和29 ± 6%）相比存在一定差异。血清类粘蛋白使三维BBB的HS含量增加至对照的1.4 ± 0.1倍，与大鼠肠系膜毛细血管后微静脉中的效应一致，而二维BBB中该效应为3.4 ± 0.6倍，说明静态条件更利于血清类粘蛋白增强HS的作用。
3. HS调节对三维BBB通透性的影响
肝素酶III降解HS后，P_NaFl增加至2.8倍（从2.09 ± 0.75到5.81 ± 0.75 × 10⁻⁶厘米/秒），P_Dex-70k增加至1.9倍（从2.77 ± 0.22到5.27 ± 0.12 × 10⁻⁷厘米/秒）。相反，血清类粘蛋白增强HS后，P_NaFl降至56.7%，P_Dex-70k降至55.2%。VEGF对三维BBB通透性具有急性效应：在灌注后30秒内两种示踪剂的通透性即达到峰值，P_NaFl增加7.9倍，P_Dex-70k增加11.4倍；与大鼠脑微血管中2分钟恢复基线不同，三维BBB在8分钟时仍维持约5–7倍的高通透性。
4. HS调节对MB231细胞粘附的影响
在无预处理条件下，每50,000平方微米微通道中段面积上有20 ± 5个MB231细胞粘附。仅对BBB用肝素酶III预处理时，粘附增加2.3倍；同时处理BBB和MB231细胞时，粘附数量与对照组无差异，说明同时降低两者的HS可中和该效应。VEGF同时处理两者可使粘附增加3.4倍；血清类粘蛋白同时处理两者则将粘附降至63%。与二维静态条件相比，生理流动显著增强了HS调节对MB231粘附的效应。
本研究成功构建了一种成本效益高、易于组装的三维人体微通道BBB模型。该模型具有圆形截面、约100微米直径，能在生理剪切力条件下模拟脑微血管的结构与功能。其小分子和大分子通透性与大鼠脑微血管高度一致。该模型能够重现血清类粘蛋白、VEGF和肝素酶III对大鼠脑或肠系膜微血管通透性及HS调节的效应，也能复制MB231乳腺癌细胞在上述调节条件下的粘附行为。由于人体脑微血管难以获取，这一廉价且易组装的三维人体BBB模型可广泛应用于健康和疾病状态下BBB调节机制的研究，并可用于开发针对脑转移瘤的治疗干预策略。
本研究的突出亮点包括：第一，模型构建方法简单，无需洁净室或复杂微加工技术，在普通湿实验室即可完成，显著降低了三维BBB模型的门槛；第二，该模型具有圆形截面，更真实地模拟了体内微血管的流动和剪切力分布；第三，模型对小分子和大分子的通透性与大鼠脑微血管高度一致，证明了其在功能模拟上的可靠性；第四，该模型不仅能模拟BBB的基础功能，还能复制多种生理调节剂和病理因子对BBB通透性及肿瘤细胞粘附的影响，具有广泛的应用前景。
本研究还提供了详细的模型构建和通透性测量方案（见补充材料S1和S2），这为其他实验室重复和推广该模型提供了便利。此外，研究中关于流动条件与静态条件在HS调节效应和肿瘤细胞粘附效应上的差异，为理解剪切力在BBB功能和肿瘤转移中的作用提供了新的实验依据。