本文作者为Yoshihiro Shimizu、Takashi Kanamori和Takuya Ueda，分别来自东京大学前沿科学研究生院医学基因组科学系以及日本Post Genome Institute Co., Ltd.。该文发表于Methods期刊2005年第36卷第299–304页，是一篇方法学论文，系统介绍了PURE（Protein synthesis Using Recombinant Elements）无细胞蛋白质合成系统的原理、组成、标准操作流程以及其在活性蛋白质制备和翻译研究中的应用。

论文首先阐述了无细胞蛋白质合成技术发展的学术背景。随着基因组学研究从序列获取转向功能解析，如何快速、高效地制备大量具有活性的蛋白质成为化学生物学、结构生物学和药物生物学等领域的核心需求。传统的体内重组表达系统虽然在产量上具有优势，但操作繁琐、周期较长，且在表达某些易聚集或难表达的蛋白质时存在局限。相比之下，基于细胞提取物的无细胞蛋白质合成系统虽然简化了操作，但由于提取物成分复杂，其中存在核酸酶、蛋白酶等干扰因素，系统的可控性和透明度仍然不足。为了克服这些限制，作者所在团队在Weissbach等人早期工作的基础上，构建了一种完全由纯化重组元件组成的PURE系统。

PURE系统的核心特征在于它仅包含大肠杆菌翻译所必需的最少成分。该系统涵盖了翻译起始、延伸、终止和核糖体循环所需的全部十种翻译因子，包括起始因子IF1、IF2、IF3，延伸因子EF-G、EF-Tu、EF-Ts，释放因子RF1、RF2、RF3以及核糖体循环因子RRF。此外，为了支持从DNA模板开始的完整蛋白质合成过程，PURE系统还整合了T7 RNA聚合酶、焦磷酸酶、20种氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）、肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶等辅助酶类。所有蛋白质因子均以His标签融合形式表达和纯化，而核糖体则通过蔗糖密度梯度离心制备。该系统的成分组成在表1中给出，包括能量来源如ATP、GTP、CTP、UTP和磷酸肌酸，缓冲液体系如HEPES-KOH、谷氨酸钾、醋酸镁、亚精胺和二硫苏糖醇，以及氨基酸混合物、tRNA混合物和10-甲酰基四氢叶酸等。

在标准操作流程方面，论文详细描述了以PURESystem试剂盒进行蛋白质合成与纯化的步骤。模板可以是质粒DNA、PCR片段或mRNA。DNA模板需要带有T7启动子和核糖体结合位点（Shine–Dalgarno序列），开放阅读框必须以ATG起始密码子开始，以终止密码子结束。若使用质粒模板，还需要在终止密码子下游加入T7终止子序列。反应在37°C下进行1–2小时，所需步骤仅为将模板加入试剂盒组分中混合孵育。合成后的蛋白质可以直接分析，也可以进行快速纯化。PURE系统的独特之处在于其“反向”纯化策略：由于所有蛋白质因子都带有His标签，反应结束后向体系中加入Ni²⁺螯合树脂，His标签蛋白质因子被树脂结合，随后通过100 kDa截留分子量的超滤膜同时去除树脂和核糖体，最终留在溶液中的蛋白质即为目标产物。文中以DHFR蛋白为例说明，经该方法纯化后，SDS-PAGE上仅检测到DHFR蛋白条带。

针对提高蛋白质正确折叠效率的问题，本文还报道了两种新的反应条件改进策略。第一种是在PURE系统中添加分子伴侣。研究表明，某些蛋白质在无伴侣系统中合成时会形成不溶性聚集体。例如，单链Fv抗体（scFv）在无伴侣条件下合成时活性较低，但当体系中加入1 μM DnaK、0.4 μM DnaJ和0.4 μM GrpE后，scFv的溶解性和抗原结合活性均显著提高。另一方面，部分蛋白质需要伴侣素（chaperonin）协助折叠。论文中以大肠杆菌DapA蛋白为例，显示在1 μM GroEL和2 μM GroES存在下，DapA蛋白的可溶性显著改善，经离心后上清组分中检测到目标蛋白，而对照组中该蛋白主要存在于沉淀组分。这些结果表明，根据目标蛋白质的特性选择合适的分子伴侣，可以有效改善PURE系统中的蛋白质折叠状况。

第二种改进策略是构建氧化条件下的PURE系统。由于细胞质中的翻译环境通常为还原态，原始PURE系统也采用了含二硫苏糖醇的还原条件。然而，许多分泌蛋白和胞外功能蛋白需要形成正确的二硫键才能获得活性。为满足此类蛋白质的合成需求，研究者通过以氧化型谷胱甘肽替代二硫苏糖醇，并在体系中加入蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase），开发了氧化型PURE系统，即PURESystem S–S试剂盒。文中以含有两个二硫键的大肠杆菌碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）为模型蛋白，比较了还原型和氧化型PURE系统合成的碱性磷酸酶活性。结果显示，原始还原型系统中合成的碱性磷酸酶活性较低，而氧化型系统中合成的碱性磷酸酶活性提高了数倍。尽管与市售天然碱性磷酸酶相比仍有差距，但这一结果证明了通过调节PURE系统的氧化还原条件可以显著改善含二硫键蛋白的折叠与功能。

在应用前景方面，论文进一步讨论了PURE系统在非天然氨基酸掺入和蛋白质体外选择中的潜力。由于PURE系统是高度可控的纯化翻译体系，研究者可以利用化学或酶法装载的抑制型tRNA（suppressor tRNA），在mRNA编码序列内部引入终止密码子，由抑制型tRNA特异性读取该终止密码子并将非天然氨基酸掺入蛋白质的特定位点。此外，PURE系统也非常适合用于核糖体展示（ribosome display）、体外病毒（in vitro virus）和mRNA展示（mRNA display）等基因型—表型偶联的蛋白质筛选技术。论文还提到，在PURE系统中可以通过去除特定释放因子来避免释放因子与抑制型tRNA之间的竞争，从而提高琥珀终止密码子（amber stop codon）的通读效率。PURE系统缺乏降解mRNA的核酸酶，也使其特别适用于需要保持mRNA稳定性的筛选体系。

整体来看，本文的价值在于系统性地展示了PURE系统作为一种高度可控、成分明确的无细胞蛋白质合成平台，在活性蛋白质制备、蛋白质折叠研究以及多种体外分子筛选应用中具有显著优势。其核心亮点包括：第一，通过纯化重组元件构建的最小翻译体系消除了细胞提取物中干扰因子的影响，使得翻译条件的调控更加精确；第二，利用His标签和超滤策略实现了单一目标蛋白的快速反向纯化，大幅简化了蛋白质纯化流程；第三，通过引入分子伴侣和氧化还原条件调节，成功拓展了PURE系统在难表达蛋白质和含二硫键蛋白质合成方面的能力。论文还指出，虽然PURE系统在多个方面表现出色，但与活细胞相比仍缺乏多种辅助子系统，例如RNA解旋酶和稳定mRNA的蛋白等，因此针对某些特殊模板或复杂蛋白质的合成仍需进一步优化。总体而言，PURESystem的建立和不断改进为蛋白质功能研究、合成生物学和药物开发等研究领域提供了一种灵活、透明和可定制的重要工具。