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TNF-α通过CXCL10/CXCR3轴诱导结肠癌细胞上皮-间质转化的机制研究

作者及机构
本研究由Zhengcheng Wang（青岛大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系）、Xiang Ao（陆军军医大学大坪医院干细胞与再生医学系）等共同完成，通讯作者为Ling Li（青岛大学）和Xiang Xu（陆军军医大学）。研究成果发表于*International Journal of Biological Sciences*（2021年6月，卷17，期11，页码2683-2702）。

学术背景

研究领域与动机
慢性炎症诱导的转移是癌症治疗的主要障碍之一。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为肿瘤微环境（TME）中的核心炎症介质，可通过调控多种趋化因子形成复杂网络促进肿瘤发展。CXCL10/CXCR3轴已被报道影响癌细胞侵袭性，而上皮-间质转化（EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition）是结肠癌（CC, Colon Cancer）转移的关键机制。然而，TNF-α是否通过诱导趋化因子表达协同增强EMT介导的结肠癌转移尚不明确。本研究旨在揭示TNF-α/CXCL10/CXCR3轴在结肠癌转移中的作用机制。

背景知识
- EMT：上皮细胞通过失去极性、获得间质表型，增强迁移和侵袭能力，是肿瘤转移的核心环节。
- CXCL10/CXCR3轴：CXCL10是免疫细胞分泌的促炎因子，其受体CXCR3在多种肿瘤中高表达，与不良预后相关。
- TNF-α：作为炎症关键调控因子，可激活NF-κB、PI3K/AKT等通路，但长期低剂量TNF-α可能促进肿瘤进展。

研究流程与方法

1. 细胞培养与模型构建
- 研究对象：结肠癌细胞系SW480（原发灶来源）和SW620（转移灶来源），购自美国ATCC。
- 处理：细胞经TNF-α（0-20 ng/mL）或CXCL10（200 ng/mL）刺激，分别检测CXCL10/CXCR3表达及EMT标志物变化。
- 抑制剂实验：使用PI3K抑制剂（LY294002）、AKT抑制剂（MK-2206）、p38 MAPK抑制剂（SB203580）和NF-κB抑制剂（BAY11-7082）预处理细胞，明确通路作用。

2. 分子机制验证
- 信号通路分析：通过Western blot（WB）检测PI3K/AKT、p38 MAPK和NF-κB通路蛋白磷酸化水平，发现TNF-α通过p38 MAPK和PI3K/AKT平行通路激活NF-κB p65核转位，进而启动CXCL10转录。
- 启动子活性实验：构建CXCL10启动子荧光素酶报告基因质粒，证实NF-κB p65结合位点（-172/-117）是TNF-α调控CXCL10的关键区域。

3. 功能实验
- 迁移与侵袭：划痕实验和Transwell实验显示，CXCL10通过CXCR3显著增强SW480/SW620细胞的迁移和侵袭能力，且依赖于RhoA和CDC42小GTP酶的激活。
- EMT表型分析：免疫荧光和qPCR显示，CXCL10下调E-cadherin、Occludin等上皮标志物，上调N-cadherin、Vimentin等间质标志物，诱导细胞形态向纺锤形转变。

4. 动物模型
- 体内成瘤实验：裸鼠皮下接种CXCL10过表达的SW480/SW620细胞，21天后肿瘤体积和Ki-67表达显著增加；尾静脉注射后，肺转移灶数量明显增多。

5. 数据统计
- 采用GraphPad Prism 9.0进行单因素ANOVA和Sidak多重比较检验，数据以均值±标准差表示（n=3）。

主要结果

1. TNF-α上调CXCL10/CXCR3表达

   • TNF-α以浓度和时间依赖性方式诱导CXCL10 mRNA和蛋白表达（ELISA和qPCR验证），且在转移性SW620细胞中效应更强（图1E-F）。
     
   • CXCR3在结肠癌组织中高表达（GEPIA数据库分析），与患者生存率负相关（图1B-C）。
     

2. 信号通路机制

   • TNF-α通过PI3K/AKT和p38 MAPK通路激活NF-κB p65核转位，后者结合CXCL10启动子（-250/+8区域）驱动转录（图2-3）。
     
   • 抑制剂联用（PI3K+p38 MAPK）可完全阻断CXCL10上调，效果与NF-κB抑制剂相当（图2B）。
     

3. CXCL10/CXCR3轴促转移

   • CXCL10通过CXCR3激活PI3K/AKT/GSK-3β通路，抑制GSK-3β磷酸化，稳定Snail蛋白，进而下调E-cadherin、促进EMT（图5-6）。
     
   • 体内实验证实CXCL10过表达增强肿瘤生长和肺转移（图7）。
     

结论与意义

科学价值
- 首次阐明TNF-α通过p38 MAPK/PI3K/AKT/NF-κB轴上调CXCL10，进而激活CXCR3/PI3K/AKT/GSK-3β/Snail通路诱导EMT的级联机制。
- 提出CXCL10/CXCR3轴可作为结肠癌转移的潜在治疗靶点，尤其是针对炎症微环境驱动的转移。

应用前景
- 为开发CXCR3拮抗剂或NF-κB抑制剂提供理论依据，可能改善结肠癌患者的预后。

研究亮点

1. 创新性机制：揭示TNF-α/CXCL10/CXCR3/EMT轴在结肠癌转移中的完整信号网络。
   
2. 多模型验证：结合体外细胞模型、基因编辑（siRNA敲降）和体内动物实验，数据层次丰富。
   
3. 临床关联性：通过GEPIA数据库和临床样本分析，明确CXCR3高表达与患者不良预后的相关性。
   

局限性
- 未探讨其他趋化因子（如CXCL9/CXCL11）在TNF-α调控网络中的作用。
- 动物模型未模拟慢性炎症微环境的长期效应。

其他价值
研究提出的“趋化因子-受体-靶器官”转移模型（图8）为肿瘤器官特异性转移机制提供了新视角。