学术研究报告：基于聚咪唑刷修饰纳米移液管的实时原位细胞内ATP检测技术

一、研究团队与发表信息
本研究由中国科学院化学研究所生命分析化学实验室的Kailin Zhang、Tianyi Xiong、Fei Wu等共同完成，通讯作者为Ping Yu和Lanqun Mao。研究成果发表于Science China Chemistry 2020年7月刊（Vol. 63, No. 7），标题为《Real-time and in-situ intracellular ATP assay with polyimidazolium brush-modified nanopipette》，DOI号为10.1007/s11426-020-9715-x。

二、学术背景与研究目标
三磷酸腺苷（ATP，Adenosine 5’-triphosphate）是细胞能量代谢的核心分子，其动态变化与DNA复制、酶促反应及神经活动等生理病理过程密切相关。传统ATP检测方法（如荧光探针和电化学传感器）存在定量困难、空间分辨率低或响应速度慢等问题。本研究旨在开发一种基于聚咪唑刷（Polyimidazolium Brush, PIMB）修饰纳米移液管的新型纳米传感器，实现单细胞水平ATP的高选择性、高时空分辨率及可逆性检测，并探索其在病理模型（如帕金森病相关DJ-1蛋白缺失）中的应用价值。

三、研究流程与方法
1. 纳米传感器设计与制备
- 材料合成：通过原子转移自由基聚合（ATRP）在纳米移液管（直径约300 nm）内壁修饰聚（1-乙烯基-3-丁基咪唑）刷（PVBIMB），利用咪唑阳离子与ATP的超分子相互作用（氢键、π-π堆积及疏水作用）实现特异性识别。
- 表征验证：通过电流-电压（I-V）曲线和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实PVBIMB成功修饰及ATP结合机制。FT-IR显示ATP的PO₃⁻和P=O键红移，表明其与咪唑环形成氢键。

1. 传感器性能测试

   • 选择性：在生理浓度干扰物（如多巴胺、ADP、葡萄糖）存在下，传感器仅对ATP产生显著电位响应（10 mM ATP信号强度为其他分子的5-10倍）。
     
   • 灵敏度与线性范围：恒定电流（1 nA）下，电位变化与ATP浓度（1-10 mM）呈线性关系（δE=14.2Cₐₜₚ−9.51，R²=0.998），检测限达微摩尔级。
     
   • 响应速度与可逆性：响应时间为2.0±0.8秒，且可通过切换ATP/无ATP溶液实现快速可逆检测（图3e）。
     

2. 细胞内ATP检测应用

   • 细胞模型：选用PC12细胞（n=15）和DJ-1基因敲除小鼠的嗜铬细胞（n=28野生型，n=31敲除型）。
     
   • 操作流程：纳米传感器通过显微操作插入活细胞，施加1 nA恒定电流记录电位变化（图5a-b）。
     
   • 动态监测：通过葡萄糖（10 mM）和2,4-二硝基苯酚（DNP，150 μM）调控细胞代谢，实时观测ATP水平变化（图6）。

四、主要研究结果
1. 传感器性能验证：PVBIMB修饰纳米移液管对ATP的识别依赖于超分子相互作用，疏水链长度（丁基vs.己基）可调节检测范围（图2d）。
2. 细胞内ATP定量：PC12细胞的ATP浓度为4.5±1.2 mM，与文献一致；DJ-1缺失导致嗜铬细胞ATP水平显著降低（2.2±0.9 mM vs. 野生型3.1±0.9 mM，p<0.01），提示线粒体功能障碍（图5c）。
3. 动态监测能力：葡萄糖刺激使ATP升高，DNP（解偶联剂）则抑制ATP生成，证实传感器可实时追踪代谢过程（图6）。

五、研究结论与价值
本研究首次将纳米移液管与超分子识别结合，开发出兼具高选择性、快速响应和低细胞毒性的ATP纳米传感器。其科学价值在于：
1. 方法学创新：通过离子传输调控和超分子设计，解决了电化学方法检测非电活性分子的难题。
2. 病理机制揭示：证实DJ-1蛋白缺失通过降低ATP水平参与帕金森病发病，为靶向治疗提供新思路。
3. 技术普适性：该策略可拓展至其他生物分子检测，推动单细胞分析领域发展。

六、研究亮点
1. 超分子识别机制：利用PVBIMB与ATP的多重相互作用实现高选择性，避免酶或抗体依赖。
2. 纳米尺度优势：300 nm尖端直径和低极化电流（1 nA）确保细胞存活率（Trypan Blue验证）。
3. 动态监测能力：2秒级响应时间优于传统荧光探针（分钟级），适用于代谢过程实时追踪。

七、其他价值
研究团队开发的可逆性检测系统（图3e）和长期稳定性（60天性能保持，图3f）为临床样本检测奠定了基础。此外，通过比较不同碳链长度（丁基/己基）对检测范围的影响（图2d），为传感器设计提供了普适性指导原则。