学术研究报告：Th17细胞来源的Amphiregulin通过激活肌成纤维细胞mTOR和MEK通路促进克罗恩病肠道纤维化
一、 研究作者、机构与发表信息
本项研究由Xiaojing Zhao（赵晓静，南京医科大学第一附属医院）和Wenjing Yang（杨文静，德克萨斯大学医学分部）作为共同第一作者领衔，通讯作者为Yingzi Cong（丛英姿，德克萨斯大学医学分部）。研究团队汇聚了来自美国德克萨斯大学医学分部、南京医科大学第一附属医院、宾夕法尼亚州立大学赫尔希医学中心、希望之城贝克曼研究所、印第安纳大学等多个机构的研究人员。该研究成果以题为《Th17 cell-derived amphiregulin promotes colitis-associated intestinal fibrosis through activation of mTOR and MEK in intestinal myofibroblasts》的论文形式，于2023年发表在国际消化领域顶级期刊Gastroenterology（第164卷，第1期，第89-102页）上。
二、 研究学术背景
本研究的科学领域聚焦于炎症性肠病，特别是克罗恩病（Crohn’s disease, CD）的并发症机制。肠道纤维化是克罗恩病的一种严重并发症，其特征是肠道细胞外基质（ECM）过度沉积，导致肠壁增厚、肠腔狭窄（狭窄），最终往往需要手术干预。目前，临床上尚缺乏针对纤维化机制的有效治疗药物。
已知慢性炎症是驱动纤维化的关键因素。在克罗恩病中，针对肠道菌群抗原的辅助性T细胞，特别是Th1和Th17细胞，在疾病发病机制中扮演核心角色。然而，尽管Th1和Th17细胞都能诱发肠道炎症，但它们在驱动纤维化方面的具体作用和机制差异尚不完全清楚。尤其是，Th17细胞是否以及如何通过不同于诱发炎症的途径来促进纤维化，是一个悬而未决的科学问题。此外，临床观察发现，即使使用抗肿瘤坏死因子（TNF）等药物抑制了炎症，纤维化仍可能进展，这提示存在独立于炎症的纤维化调控机制。
因此，本研究旨在深入探究Th17细胞诱导肠道纤维化的具体细胞与分子机制。其核心科学目标是：比较Th1与Th17细胞在诱导纤维化能力上的差异；鉴定Th17细胞中驱动纤维化的关键效应分子；阐明该分子在体内外促进纤维化的信号通路；并验证该分子在克罗恩病患者纤维化组织中的表达情况，从而为开发抗纤维化靶向疗法提供新的理论依据和潜在靶点。
三、 详细研究流程
本研究采用了多层次、多模型的系统研究方法，结合体内动物实验、体外细胞实验以及临床样本分析，流程严谨且环环相扣。
流程一：Th17细胞诱导更严重肠道纤维化的体内验证 * 研究对象与样本量：首先，研究使用了T细胞受体βδ双敲除（Tcrbxd-/-）小鼠作为受体模型。这类小鼠缺乏内源性T细胞，适合进行过继性T细胞转移。供体细胞来自能特异性识别肠道菌群抗原Cbir1鞭毛蛋白的Cbir1 T细胞受体转基因（Cbir1 Tg）小鼠。研究人员从Cbir1 Tg小鼠中分离CD4+ T细胞，在体外分别诱导分化为Th1和Th17细胞。 * 实验处理与方法：将等量的极化后Th1或Th17细胞过继转移至Tcrbxd-/-小鼠体内。6周后处死小鼠进行评估。 * 检测与分析：1) 组织病理学评分：评估结肠炎症严重程度。2) 细胞因子检测：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量结肠器官培养上清中的TNF-α和IL-6水平，评估炎症强度。3) 纤维化评估：a) 天狼星红染色：量化结肠组织中总的胶原沉积层厚度。b) 实时定量PCR（qRT-PCR）：检测纤维化相关基因（Col1a1, Col6a1, Col6a3）的mRNA表达。c) 免疫荧光染色：特异性检测I型胶原蛋白（Collagen I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，活化的肌成纤维细胞标志物）的表达与分布。
流程二：Th17细胞高表达Amphiregulin（Areg）的发现与验证 * 研究对象：野生型（WT）小鼠脾脏CD4+ T细胞，以及Cbir1 Tg小鼠的CD4+ T细胞。 * 实验与方法：1) 基因芯片分析：对体外极化培养的Th0、Th1、Th17细胞进行全基因组表达谱分析，筛选差异表达基因。2) 靶向验证：将Cbir1 Tg小鼠CD4+ T细胞在Th0、Th1、Th2、Th17条件下极化培养5天。3) 表达检测：使用qRT-PCR检测Areg的mRNA水平，使用ELISA检测细胞培养上清中Areg的蛋白分泌水平。4) 体内验证：检测流程一中Th1或Th17细胞受体小鼠结肠组织的Areg mRNA表达。
流程三：Areg在肠道纤维化中关键作用的体内功能缺失验证 * 模型一：Areg基因全局敲除小鼠模型 * 研究对象：野生型（WT）和Areg基因敲除（Areg-/-）小鼠，每组5只。 * 处理：使用葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）诱导慢性结肠炎/纤维化模型（三个循环的DSS给药）。 * 评估：同流程一，评估炎症评分、胶原沉积（天狼星红、Collagen I免疫荧光）、胶原基因表达及α-SMA表达。 * 模型二：Areg缺失的Th17细胞过继转移模型 * 研究对象：从WT和Areg-/-小鼠分离CD4+ T细胞，体外极化培养为Th17细胞，然后过继转移至Tcrbxd-/-小鼠（每组5只）。 * 处理与评估：4周后处死小鼠，评估结肠炎症和纤维化指标（Collagen I和α-SMA免疫荧光）。
流程四：Th17细胞中Areg表达的上游调控机制研究 * 研究对象：WT小鼠和Stat3基因敲除（Stat3-/-）小鼠的CD4+ T细胞。 * 实验与方法：1) 转录因子抑制：在Th17极化培养中加入RORγt抑制剂（GSK805），检测对Areg表达的影响。2) 细胞因子刺激：在T细胞培养中单独或联合添加IL-6、IL-23、IL-1β、IL-17、IL-21等细胞因子，分析对Areg表达的调控作用。3) 时间与剂量依赖实验：检测不同时间和剂量IL-6刺激对Areg表达的影响。4) 信号通路验证：通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测IL-6/IL-21刺激后STAT3的磷酸化水平。5) 遗传学验证：使用Stat3-/-小鼠的CD4+ T细胞，验证IL-6和IL-21诱导Areg表达是否依赖于STAT3。
流程五：STAT3抑制剂对Th17诱导纤维化的干预研究 * 研究对象：过继转移了Cbir1特异性Th17细胞的Tcrbxd-/-小鼠（每组4只）。 * 处理：从细胞转移当天开始，每隔一天腹腔注射STAT3特异性抑制剂HJC0152（10 mg/kg）。 * 评估：4周后，评估结肠炎症（病理评分、TNF-α/IL-6 ELISA）和纤维化指标（天狼星红染色、Col1a1/Col6a1 qRT-PCR、Collagen I/α-SMA免疫荧光）。
流程六：Areg直接作用于人肠道肌成纤维细胞的机制研究 * 研究对象：从克罗恩病患者手术切除肠段分离培养的原代人肠道肌成纤维细胞（Myofibroblasts, MFs）。 * 实验与方法：1) 增殖实验：用Areg（100 ng/ml）处理MFs 48小时，通过Ki67免疫荧光染色计数增殖细胞比例。2) 迁移实验：“划痕”愈合实验，动态记录Areg处理24小时内伤口闭合面积。3) 胶原表达：qRT-PCR检测Col1a1 mRNA表达。4) 信号通路探查：Western Blot检测Areg处理后MFs中STAT3、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和MEK的磷酸化水平。5) 通路抑制实验：在使用Areg的同时，加入mTOR抑制剂（雷帕霉素，Rapamycin）或MEK抑制剂（U0126），观察对MFs增殖、迁移和Col1a1表达的抑制作用。6) 上游受体验证：检测Areg处理后表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化。
流程七：Areg在克罗恩病患者中的表达验证 * 研究对象：三组人群：健康对照者、无纤维化的克罗恩病患者、伴有纤维化的克罗恩病患者。收集肠道活检组织、外周血以及手术切除肠段的纤维化与非纤维化部位组织。 * 实验与分析：1) 组织水平：qRT-PCR检测肠道活检组织中Areg的mRNA表达。2) 单细胞水平：a) 免疫荧光：对肠组织切片进行CD4和Areg共染色。b) 流式细胞术：从同一患者纤维化与非纤维化部位分离肠道固有层淋巴细胞，分析CD4+ T细胞中Areg+细胞的比例。3) 体外极化验证：从健康对照和纤维化CD患者外周血分离CD4+ T细胞，体外分别诱导为Th1和Th17细胞，比较其Areg表达水平。
数据统计：所有数据均使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，采用Student’s t检验、Mann-Whitney U检验或单因素方差分析（ANOVA），以P < 0.05为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果
结果一： 体内实验证实，虽然过继转移Th1和Th17细胞能在Tcrbxd-/-小鼠中诱发相似程度的结肠炎（相似的病理评分和TNF-α/IL-6水平），但Th17细胞诱导的肠道纤维化显著更为严重。这表现为Th17受体小鼠的胶原沉积层更厚、I型胶原（Col1a1）的mRNA和蛋白表达更高、α-SMA阳性活化的肌成纤维细胞层更厚。这一关键发现将研究焦点引向寻找Th17细胞特有的、独立于炎症强度的促纤维化因子。
结果二： 基因芯片分析揭示，在众多差异表达基因中，Areg在Th17细胞中的表达量是Th1细胞的2.35倍。后续验证实验证实，Th17细胞与已知高表达Areg的Th2细胞类似，在mRNA和蛋白水平均高表达Areg，而Th0和Th1细胞表达量极低。此外，Th17细胞受体小鼠结肠组织中Areg表达也更高。这首次明确了Areg是Th17细胞的一个特征性高表达产物。
结果三： 功能缺失实验提供了Areg促纤维化作用的直接证据。在DSS慢性模型中，Areg-/-小鼠虽然结肠炎更重（提示Areg可能具有抗炎作用），但其肠道纤维化却显著减轻，胶原沉积和α-SMA表达减少。更重要的是，在过继转移实验中，Areg-/- Th17细胞诱导的纤维化程度远低于WT Th17细胞，而两者产生的IL-17水平相当。这强有力地证明，Th17细胞通过分泌Areg来驱动纤维化，且该作用与其促炎功能（如分泌IL-17）是相互独立的。
结果四： 上游机制研究发现，Th17细胞极化本身（通过转录因子RORγt）促进了Areg表达。在众多Th17相关细胞因子中，IL-6和IL-21能有效上调T细胞中Areg的表达，且呈时间和剂量依赖性。IL-23和IL-1β无此作用。机制上，IL-6和IL-21通过激活STAT3信号通路来诱导Areg，因为它们在Stat3-/- T细胞中完全失去了诱导Areg的能力。相应地，在体内使用STAT3抑制剂（HJC0152）治疗，可以显著抑制Th17细胞诱导的肠道纤维化，同时减轻炎症。
结果五： 下游机制研究揭示了Areg直接作用于效应细胞——肠道肌成纤维细胞（MFs）的途径。Areg处理能显著促进人肠道MFs的增殖、迁移和I型胶原表达。信号通路分析表明，Areg激活了MFs中的mTOR和MEK，而非STAT3。功能回复实验显示，mTOR抑制剂能同时阻断Areg诱导的MFs增殖、迁移和胶原产生，而MEK抑制剂仅能阻断增殖，对迁移和胶原产生无影响。这表明Areg通过激活两条平行但功能有重叠的通路来全方位增强MFs的促纤维化活性。
结果六： 临床相关性分析证实了上述发现在人类疾病中的意义。与健康对照和无纤维化的CD患者相比，伴有纤维化的CD患者肠道活检组织中Areg mRNA表达显著升高。在同一患者体内，纤维化部位的Areg表达也高于非纤维化部位。流式细胞术进一步定位发现，这种升高主要来源于肠道固有层的CD4+ T细胞。体外实验也验证，无论是健康人还是CD患者，其外周血CD4+ T细胞在极化后，Th17细胞产生的Areg均远高于Th1细胞，且CD患者来源的Th17细胞产生Areg的能力更强。
五、 研究结论与意义
本研究得出明确结论：肠道菌群反应性Th17细胞通过高表达Amphiregulin（Areg），以不依赖于其促炎功能的方式，在实验性结肠炎和人类克罗恩病中驱动肠道纤维化进程。其作用机制是一条清晰的“IL-6/IL-21 – STAT3 – Areg – EGFR – mTOR/MEK”信号轴：炎症微环境中的IL-6/IL-21通过激活Th17细胞内的STAT3，上调Areg的表达与分泌；分泌出的Areg继而作用于肠道肌成纤维细胞，通过激活其EGFR下游的mTOR和MEK通路，促进肌成纤维细胞的增殖、迁移和胶原蛋白合成，最终导致病理性纤维化。
本研究的科学价值在于：1) 阐明了Th17细胞驱动纤维化的一个全新独立机制，将Areg鉴定为Th17细胞的关键促纤维化效应分子。2) 揭示了从免疫细胞（Th17）到间质细胞（肌成纤维细胞）在纤维化中的完整信号传递链条，为理解炎症与纤维化之间的复杂关系提供了更精细的模型。3) 具有明确的转化医学价值。研究证实Areg在CD患者纤维化部位特异性高表达，且其上下游关键节点（如STAT3、mTOR、MEK）均为已知的“可成药”靶点。因此，Areg本身或其信号通路中的关键分子，有望成为治疗克罗恩病肠道纤维化的潜在新靶点，为开发无需完全抑制炎症的抗纤维化疗法提供了新思路。
六、 研究亮点
七、 其他说明
研究作者在文末也提到了本工作的一个局限性：未使用抗Areg中和抗体在动物模型中治疗已形成的纤维化，这将是未来验证其治疗潜力的重要一步。此外，研究虽然聚焦于Th17细胞，但并未排除其他细胞来源（如上皮细胞、ILC2等）的Areg在肠道纤维化中的作用，这为后续研究留下了空间。