本研究由Ryan Alkins, Alison Burgess, Milan Ganguly, Giulio Francia, Robert Kerbel, Winfried S. Wels, 和Kullervo Hynynen共同完成，其主要研究机构包括加拿大多伦多Sunnybrook研究所的物理科学平台和生物科学平台、多伦多大学的医学生物物理系，以及德国法兰克福的Georg-Speyer-Haus化学治疗研究所。该研究论文以题为“Focused Ultrasound Delivers Targeted Immune Cells to Metastatic Brain Tumors”发表在期刊*Cancer Research*，具体刊载于2013年3月15日第73卷第6期。
本研究的学术领域横跨肿瘤免疫治疗、神经外科、医学影像学和生物医学工程。研究背景在于，多达30%的乳腺癌患者会发生中枢神经系统转移，而当前针对脑转移瘤的全身性治疗方法效果有限。一个核心障碍是血脑屏障的存在，它严重限制了绝大多数治疗药物，包括大分子药物（如抗体）和细胞疗法，进入脑实质。即使肿瘤内部存在部分渗漏的“血肿瘤屏障”，其通透性仍然不足以让足够剂量的治疗剂有效渗透。HER2扩增的乳腺癌具有更强的侵袭性、更高的脑转移风险和更差的预后。虽然针对HER2的抗体和抑制剂（如拉帕替尼）在治疗全身性HER2阳性乳腺癌方面取得进展，但它们穿越血脑屏障的能力有限。与此同时，自然杀伤细胞作为先天免疫系统的关键效应细胞，特别是经过基因工程改造、能够特异性靶向HER2的NK-92细胞株（NK-92-scFv(FRP5)-zeta），已在体外和针对颅外肿瘤的动物模型中显示出强大的抗肿瘤活性，但其治疗脑肿瘤的临床效用同样受限于无法有效穿越血脑屏障。因此，本研究旨在探索一种非侵入性、可定位的物理方法来克服这一障碍。研究的核心目标是：验证在磁共振成像引导下的聚焦超声技术，结合微泡造影剂，能否安全、有效地临时打开血脑屏障，从而将静脉注射的、靶向HER2的NK-92免疫细胞高效递送至脑内HER2阳性转移瘤部位，并评估递送后细胞的存活、定位和功能活性。这为开发一种针对脑转移瘤的新型、靶向性、非侵入性的联合治疗策略提供了临床前概念验证。
该研究的详细工作流程严谨且复杂，整合了细胞工程、动物模型、聚焦超声物理、多场强磁共振成像和组织病理学分析等多个环节。研究主要包含以下几个关键程序：首先是细胞系的准备与标记。研究人员使用了两种主要细胞系：作为靶细胞的HER2表达型人乳腺癌细胞系MDA-MB-231-HER2，以及作为效应细胞的、经过病毒转导稳定表达HER2特异性嵌合抗原受体的人NK-92细胞系。为了能在体内追踪效应细胞，在静脉注射前，NK-92细胞被转染了超顺磁性氧化铁纳米颗粒。通过免疫细胞化学和流式细胞术分别确认了肿瘤细胞HER2表达和NK细胞CD45及嵌合受体表达，并通过显微镜评估了铁纳米颗粒的转染效率。其次是动物模型的建立。研究使用雄性无胸腺裸鼠作为模型动物。通过立体定位手术，将包裹在琼脂中的MDA-MB-231-HER2肿瘤细胞植入大鼠左侧前额纹状体。待肿瘤生长至1.5-2毫米大小时，通过连续的MRI扫描监测肿瘤位置和大小，并确定治疗时机。第三部分是核心的MRI引导聚焦超声治疗流程。整个实验装置是定制化的。动物麻醉后，被固定在一个计算机控制的三轴定位系统上，其头部通过去气水浴与一个551.5 kHz的单元素聚焦超声换能器耦合。该装置被置于一台1.5T临床MRI扫描仪内，实现了超声焦点与MRI图像的空间精准配准。首先进行基线MRI扫描，包括T2加权、T1加权及对比增强T1加权成像，以精确定位肿瘤。治疗时，通过尾静脉导管同时输注稀释的微泡造影剂，并同步启动聚焦超声照射。超声参数设定为：中心频率551.5 kHz，脉冲长度10毫秒，脉冲重复频率1赫兹，总照射时间120秒，估计在脑组织内的平均峰值负压为0.33 MPa。超声照射后，立即进行对比增强T1加权MRI扫描，以确认血脑屏障/血肿瘤屏障被成功、可重复地打开，并评估其范围。第四部分是实验分组与细胞注射。研究设立了三个治疗组，所有组均通过静脉注射相同剂量（每平方米体表面积10^9个细胞）的SPIO标记的HER2特异性NK-92细胞。第一组为对照组，仅注射细胞，不进行聚焦超声血脑屏障破坏。第二组，先进行聚焦超声血脑屏障破坏，5分钟后再注射NK-92细胞。第三组，先注射NK-92细胞，30秒后立即启动聚焦超声血脑屏障破坏。这种分组设计旨在探究细胞存在于血液循环中的时机对它们进入肿瘤的影响。第五部分是治疗后细胞追踪与组织学分析。在细胞注射后约16小时，使用7T高场强MRI对动物进行扫描，获取T2*加权图像。由于铁纳米颗粒具有显著的磁敏感效应，其聚集会导致局部信号降低，从而无创地示踪NK-92细胞在肿瘤部位的积累情况。随后对动物实施安乐死，取出脑组织进行固定、切片和染色。组织学分析包括：苏木精-伊红染色评估组织形态和损伤；普鲁士蓝染色检测细胞内铁纳米颗粒（标记NK-92细胞）；以及针对CD45（人白细胞共同抗原）、穿孔素和颗粒酶B的免疫组织化学染色，以特异性识别NK-92细胞并评估其细胞毒性功能是否保留。研究人员对切片进行数字化扫描，并由两名盲法评估者对每个动物的四个连续层面进行分析，计数肿瘤边界内的效应细胞数量，并计算效应细胞与肿瘤细胞的平均比值。第六部分是体外细胞毒性测定。为了评估达到肿瘤部位的效应细胞数量是否足以杀伤肿瘤，研究还进行了体外细胞毒性实验。将不同比例的HER2特异性NK-92细胞与MDA-MB-231-HER2肿瘤细胞共培养，在2小时和24小时时间点，通过台盼蓝染色法计算死细胞比例，以验证低比例效应细胞（如研究中体内达到的1:100比例）的杀伤效力。数据分析方面，使用GraphPad Prism软件进行统计学处理。组间均值比较采用学生t检验或单因素方差分析及Tukey事后检验，显著性水平设定为P<0.05。
该研究取得了多个清晰且相互印证的重要结果。首先，聚焦超声联合微泡成功、可重复地打开了血脑屏障。对比增强MRI显示，治疗后肿瘤区域的对比剂外渗信号显著增强，平均增强幅度从治疗前的17%±8%增加到34%±10%，具有统计学意义。这为后续细胞的递送创造了物理通道。其次，高场强MRI无创追踪证实了效应细胞在肿瘤部位的聚集。7T MRI的T2*加权图像显示，在第三组（细胞注射后立即超声）中，肿瘤部位出现了显著的信号降低（变化为-17%±4%），显著高于第一组对照（-14%±7%），表明有大量铁标记的NK-92细胞在肿瘤部位聚集。这一成像结果与后续的组织学发现直接相关。第三，也是最具说服力的结果，来自详尽的组织学定量分析。数据显示，效应细胞到达肿瘤的数量高度依赖于注射时机。当不进行血脑屏障破坏时，只有极少量NK-92细胞能到达肿瘤（效应细胞:肿瘤细胞比值为0.09:100）。即使在超声破坏血脑屏障后注射细胞，到达数量依然很低（0.21:100）。然而，当NK-92细胞预先存在于血液循环中，并在此时进行超声照射，到达肿瘤的细胞数量增加了近5倍，比值达到0.95:100，且与另外两组相比差异具有高度统计学意义。这约等于注射细胞总量的0.34%成功定位到了肿瘤。这一关键结果揭示了“细胞在循环中”是超声介导其高效外渗的必要条件。组织学切片进一步展示了细节：在第三组中，可以观察到NK-92细胞密集地积聚在肿瘤内及周围的动静脉周围，甚至可见它们从血管中外渗并向肿瘤迁移的轨迹。在肿瘤附近的毛细血管中，也观察到NK-92细胞排列在血管腔的内表面。这些现象在第一组和第二组中均未观察到。第四，研究证实了经过超声处理的NK-92细胞保留了完整的细胞毒性功能。免疫组化染色显示，在肿瘤内聚集的NK-92细胞表达并释放了关键的细胞毒性介质——穿孔素和颗粒酶B，并且可以在其周围发现正处于凋亡状态的肿瘤细胞。这表明超声和微泡的物理作用并未破坏这些免疫效应细胞的核心杀伤机制。最后，体外细胞毒性实验为此提供了支持性证据：尽管在2小时时，高比例效应细胞（1:1, 1:10）显示出更强的杀伤力，但在24小时时，即使是1:100的起始比例（与体内第三组达到的比例相当）也能导致与更高比例无统计学差异的肿瘤细胞死亡。这从理论上证明，通过聚焦超声递送达到的效应细胞数量，足以对肿瘤产生有效的溶解作用。所有这些结果环环相扣：MRI证实了屏障开放，高场MRI和铁染色共同定位了细胞，分组对比和定量计数揭示了递送效率的关键条件，而功能染色和体外实验则验证了递送后细胞的治疗潜力，共同导向研究的最终结论。
本研究得出的核心结论是：磁共振成像引导的聚焦超声技术，能够作为一种安全、非侵入性且精准定位的工具，临时性破坏血脑屏障，从而显著提高静脉注射的、靶向特定肿瘤抗原（本研究为HER2）的免疫效应细胞（NK-92细胞）在脑转移瘤部位的递送效率。特别是，当效应细胞在超声照射时已存在于血液循环中，其向脑肿瘤的迁移和外渗效率最高。递送至肿瘤部位的细胞保持了其细胞毒性功能，并且达到的数量在理论上具有治疗效力。这项研究为联合使用聚焦超声和过继性细胞免疫疗法治疗脑转移瘤及其他中枢神经系统恶性肿瘤，提供了一个强有力的临床前概念验证。
本研究的科学价值和应用前景十分突出。其科学价值在于：首次在动物模型中系统性地证明了聚焦超声可以用于递送活的免疫细胞穿越血脑屏障；阐明了细胞递送效率与注射/超声时序的关键关系，为优化治疗协议提供了重要依据；建立了一套整合多模态成像、细胞标记和定量组织学分析的完整研究方法。其应用价值在于：为解决脑肿瘤治疗中“药物递送”这一根本性难题开辟了一条新途径；所涉及的NK-92细胞系具有可被重新靶向多种肿瘤抗原的灵活性，意味着该平台技术可潜在地应用于多种脑部恶性肿瘤；聚焦超声技术和NK-92细胞疗法均已进入早期临床研究阶段，因此这种联合策略具有较高的临床转化潜力，有望在未来为数以万计的脑转移瘤患者提供一种新的、靶向性强的非手术治疗选择。
本研究的亮点颇多。重要发现方面：明确了“细胞在循环中”是超声介导其高效脑内递送的关键时间窗口，这是一个极具指导意义的发现。方法学新颖性方面：创造性地将超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记、高场强T2*加权MRI活体追踪与聚焦超声递送相结合，实现了对治疗性免疫细胞体内命运的实时、无创监测。研究目标的特殊性在于：它没有局限于递送小分子化疗药或抗体，而是挑战了尺寸更大、更复杂的“活的药物”——免疫细胞，跨越了工程学、免疫学和肿瘤学的界限。此外，研究还细致地观察到了效应细胞在血管周围的特殊分布模式，并对超声促进细胞外渗的可能机制（如流体剪切应力影响、内皮活化等）进行了初步探讨，为后续机理研究指明了方向。最后，整个研究流程设计严谨，对照组设置合理，数据分析全面，从影像到病理的多层次证据相互支撑，结论可靠。尽管仍处于临床前阶段，且需进一步在生存期和肿瘤消退等终极指标上验证其疗效，但本研究无疑为脑肿瘤的靶向免疫治疗点亮了一盏新的明灯。