基于脯氨酸扫描策略增强二硫键富集肽（DRPs）进化能力的研究报告

作者及发表信息
本研究由Hongtan Liu（厦门大学）、Lulu Song（山东大学）、Xiaoting Meng（深圳湾实验室）等共同完成，通讯作者为Yu-Hsuan Tsai（深圳湾实验室）、Yizhen Yin（山东大学）和Chuanliu Wu（厦门大学）。研究成果发表于*Journal of the American Chemical Society*（J. Am. Chem. Soc.）2025年第147卷，页码24870–24883。

学术背景
二硫键富集肽（Disulfide-Rich Peptides, DRPs）尤其是具有抑制剂胱氨酸结（Inhibitor Cystine Knot, ICK）基序的肽类，因其高稳定性和特异性，被视为下一代蛋白质调节剂和治疗剂的理想支架。然而，其固有的结构刚性和缺乏可塑性严重限制了功能进化能力，成为工程化新功能的瓶颈。本研究旨在通过脯氨酸扫描策略增强ICK支架的进化能力，解决DRPs在功能多样化中的核心挑战。

科学问题与目标
传统方法（如表位移植或组合库筛选）常因支架与移植序列的几何不兼容性导致折叠效率下降。受蛋白质“支架极性”（scaffold polarity）概念的启发，研究团队提出利用脯氨酸的立体化学刚性，将其作为预编码的支架残基，实现DRPs中“支架残基”与“非支架残基”的结构解耦，从而协同提升稳定性和创新性（即进化能力）。

研究流程与方法
1. 脯氨酸扫描设计与验证
- 模型选择：以ω-芋螺毒素（ω-MVIIA，一种典型ICK肽）为模板，其天然折叠效率低（<50%），且序列保守性高。 - **扫描策略**：在ω-MVIIA的Loop 1–3区逐个替换为脯氨酸，合成15种变体（P1–P15），通过高效液相色谱（HPLC）量化氧化折叠效率。关键发现：残基Tyr13、Asp14和Ser19等保守位点替换为脯氨酸后，折叠效率显著提升（如P21变体含5个脯氨酸，折叠效率>90%）。
- 结构验证：核磁共振（NMR）显示P21保留了ICK的结拓扑结构（与野生型RMSD=1.123 Å），但脯氨酸环化侧链减少了残基间相互作用，证实了结构解耦假说。

1. 通用性验证与结构拓展

   • 跨ICK应用：在ω-六毒素-HV1a（含β-折叠的ICK）中引入脯氨酸，折叠效率从25%提升至50%。通过移植β-折叠序列至P21衍生支架（P28），折叠效率达82%，而野生型支架（P29）则产生异构体，证明脯氨酸工程增强了对结构扰动的耐受性。
     
   • 新型二硫键模式：筛选出的多环肽（如PCT2）通过4对二硫键形成独特三维结构，突破了传统ICK的拓扑限制。

2. 功能筛选与治疗应用

   • 多平台筛选：结合mRNA展示（库容10^12）和噬菌体展示（库容4×10^8），靶向临床相关蛋白Trop2和4-1BB。
     
     • mRNA展示：初筛获得低纳摩尔亲和力肽（如CK15，KD=86.2 nM），但折叠效率低（32%）。
       
     • 噬菌体展示优化：从同一cDNA库中筛选出高折叠效率（PCT2：65%）和高亲和力（KD=7.0 nM）的肽段。
       
   • CAR-T细胞治疗：基于PCT2的嵌合抗原受体（CAR）T细胞对Trop2高表达肿瘤细胞特异性杀伤，且细胞因子释放显著低于传统scFv-CAR-T，安全性更优。

主要结果与逻辑衔接
- 脯氨酸的作用机制：通过限制主链旋转和稳定转角结构，脯氨酸提升了氧化折叠效率（如P21的90% vs 野生型32%），同时通过减少残基互作增强支架极性。
- 进化能力验证：筛选出的肽段（如PCT2、PCB2）均含非天然二硫键配对（如i–v, ii–viii），证实脯氨酸工程可驱动新结构的产生。
- 治疗潜力：PCT2-CAR-T在体内外均显示高效抗肿瘤活性，且对低表达Trop2的细胞无毒性，解决了“on-target, off-tumor”难题。

结论与价值
1. 科学价值：提出“脯氨酸扫描”作为普适性策略，首次实现DRPs结构刚性与可塑性的协同优化，为蛋白质工程提供了新范式。
2. 应用价值：开发的DRPs库可高效筛选靶向多种疾病的配体，如PCT2-CAR-T展现的临床潜力，为实体瘤治疗提供新思路。
3. 方法论创新：结合mRNA展示（高多样性）与噬菌体展示（高折叠效率）的双平台筛选模式，显著提升了功能肽的发现效率。

研究亮点
- 关键发现：脯氨酸作为“预编码支架残基”可系统性增强DRPs的进化能力，突破天然ICK的序列限制。
- 技术新颖性：首次将结构解耦概念应用于DRPs工程，并开发了多环肽的高效定向进化流程。
- 跨学科意义：融合化学生物学、结构生物学和免疫治疗，推动了肽类药物从基础研究到临床转化的全链条创新。

其他价值
本研究建立的DRPs库和筛选平台可扩展至其他靶点（如GPCRs、激酶），为肽类药物的高通量开发奠定基础。此外，PCT2的独特二硫键拓扑为计算设计新型约束肽提供了结构模板。