乳酸，作为糖酵解的终产物，一度被视为代谢废物。然而，近年来，它被重新定义为肿瘤微环境中功能多样的信号分子和代谢底物。在诸如黑色素瘤、胶质母细胞瘤等高糖酵解活性的肿瘤中，肿瘤细胞自身是乳酸的主要生产者。然而，在前列腺癌等糖酵解活性较低的恶性肿瘤中，肿瘤微环境中的乳酸水平在疾病进展至去势抵抗阶段时仍会升高，这表明存在非肿瘤细胞来源的乳酸，即所谓“逆瓦博格效应”。这种现象的潜在机制及其在推动去势抵抗中的功能意义，在很大程度上仍是未知的。
本研究通过单细胞RNA测序等技术，深入探究了肿瘤微环境中乳酸对前列腺癌去势抵抗的调控作用，揭示了癌症相关成纤维细胞来源的乳酸通过诱导剪接体蛋白乳酰化修饰，促进雄激素受体可变剪接，从而导致恩杂鲁胺耐药的全新代谢-表观遗传轴。这一发现不仅阐明了前列腺癌微环境中代谢重编程与治疗抵抗之间的关键联系，也为克服去势抵抗性前列腺癌的临床治疗困境提供了新的潜在策略。
一、 研究团队与发表信息
本研究由赵迪伟、莫子君、张天佑、蔡心阳等作为共同第一作者，李振、李永红、王军作为共同通讯作者完成。研究团队主要来自中山大学肿瘤防治中心泌尿外科（华南肿瘤学国家重点实验室、广东省癌症临床研究中心）、中山大学附属第六医院泌尿外科以及湖南师范大学第一附属医院（湖南省人民医院）泌尿外科。该研究成果以题为《Lactate derived from cancer-associated fibroblasts promotes alternative splicing and castration resistance in prostate cancer》的研究论文形式，于2026年1月16日发表在期刊《Science Advances》第12卷上。
二、 学术背景与研究目的
主要科学领域：本研究属于肿瘤生物学与肿瘤代谢学交叉领域，具体聚焦于肿瘤微环境代谢、蛋白质翻译后修饰、RNA可变剪接在前列腺癌治疗抵抗中的作用机制。
研究背景： 1. 乳酸的双重角色：乳酸不仅是能量代谢的中间产物，可作为燃料进入三羧酸循环，还是一种重要的信号分子，参与调节免疫微环境、细胞信号转导，促进肿瘤进展和治疗抵抗。 2. “逆瓦博格效应”：在某些癌症（如肺癌、乳腺癌、结直肠癌）中，观察到基质细胞（尤其是癌症相关成纤维细胞）的葡萄糖代谢增强，产生乳酸和丙酮酸，并被癌细胞摄取利用，这种现象被称为“逆瓦博格效应”。在去势抵抗性前列腺癌中也观察到基质细胞葡萄糖代谢的上调，但其机制和功能意义不明。 3. 雄激素受体可变剪接与去势抵抗：在前列腺癌中，雄激素受体（Androgen Receptor, AR）的可变剪接可产生超过20种不同的剪接变体。其中，缺乏配体结合结构域的AR-V7变体被证实与去势抵抗密切相关。可变剪接的调控涉及复杂的剪接体动力学，但其受肿瘤微环境中代谢因子调控的机制知之甚少。 4. 蛋白质乳酸化修饰：近年研究发现，乳酸可作为酰基供体，引起组蛋白和非组蛋白的乳酸化修饰，从而影响基因表达和细胞功能。然而，此前研究多关注肿瘤细胞自身产生的乳酸所诱导的乳酸化。
研究目的：本研究旨在探究在前列腺癌这种低糖酵解活性的肿瘤中，基质细胞来源的乳酸是否以及如何通过调控AR可变剪接，促进去势抵抗。具体目标包括：1) 鉴定在恩杂鲁胺（Enzalutamide, Enz）耐药后扩增的特定CAF亚群；2) 揭示该CAF亚群促进耐药的关键分泌因子；3) 阐明该分泌因子诱导AR-V7表达的分子机制；4) 探索靶向该通路克服恩杂鲁胺耐药的潜在治疗策略。
三、 详细研究流程
本研究是一个多层次、系统性的探索过程，结合了临床样本分析、体外细胞实验、动物模型验证以及多种组学技术。
流程一：单细胞RNA测序鉴定与恩杂鲁胺耐药相关的CAF亚群 * 研究对象与样本量：收集了4对配对患者的PCa组织样本，分别来自恩杂鲁胺初治（Enz-naïve）和恩杂鲁胺耐药（Enz-resistant）阶段，共计8个样本。 * 实验方法：对上述组织进行单细胞RNA测序，共获得157,381个细胞的转录组数据。通过生物信息学分析（使用Seurat R包进行质量控制、归一化、整合、降维和聚类），解析了肿瘤微环境中主要细胞群的比例变化。 * 数据处理与分析流程：对获得的单细胞数据，首先进行质控过滤，然后使用Harmony R包校正批次效应。通过主成分分析和统一流形逼近与投影进行降维可视化。构建共享最近邻图进行细胞聚类，识别主要细胞类型。特别对成纤维细胞群进行了重新分群（得到10个亚群C0-C9），并通过基因表达谱分析、拟时序轨迹分析等对亚群进行表征。 * 关键发现：分析显示，在获得恩杂鲁胺耐药后，肿瘤微环境中的成纤维细胞群体显著扩增。其中，C4亚群在耐药样本中比例明显增加。该亚群特异性高表达APCDD1基因，因此被定义为APCDD1+ CAFs。进一步亚型分析表明，该群CAF具有血管性CAF的特征。免疫荧光染色在临床组织样本中证实了APCDD1+ CAF的存在，且在去势抵抗性前列腺癌组织中其丰度更高。生存分析显示，APCDD1+ CAF的高丰度与患者更差的无进展生存期和总生存期相关。
流程二：验证APCDD1+ CAFs对恩杂鲁胺耐药和AR-V7表达的促进作用 * 研究对象：从PCa组织中通过流式细胞术分选出的APCDD1+ CAFs和APCDD1- CAFs，以及AR依赖性前列腺癌细胞系（如C4-2， LNCaP）和患者来源的类器官。 * 实验方法： 1. 间接共培养：使用Boyden小室将CAF与癌细胞间接共培养，评估在恩杂鲁胺存在下，CAF对癌细胞克隆形成能力的影响。 2. 条件培养基处理：收集持续恩杂鲁胺处理下的APCDD1+ CAFs和APCDD1- CAFs的条件培养基，分别称为A+CTM和A-CTM，用于处理癌细胞。 3. 体内实验：将C4-2细胞与CAF共同注射到去势的NSG小鼠体内，并给予恩杂鲁胺治疗，观察肿瘤生长。 4. RNA测序与功能验证：对A+CTM处理的C4-2细胞进行RNA测序，通过基因集富集分析寻找通路线索。利用RT-PCR和Western Blot检测AR-V7表达。使用AR-V7蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）验证AR-V7在耐药中的作用。 * 关键发现：间接共培养和条件培养基实验均证实，只有APCDD1+ CAFs（或其条件培养基A+CTM）能够诱导AR依赖性癌细胞在恩杂鲁胺存在下增殖、形成克隆，并上调AR-V7表达。RNA测序显示，A+CTM处理的细胞中RNA剪接相关通路显著富集。体内实验进一步证明，APCDD1+ CAFs能促进肿瘤在恩杂鲁胺治疗下的生长。使用AR-V7 PROTAC降解AR-V7后，A+CTM诱导的恩杂鲁胺耐药被逆转。
流程三：鉴定APCDD1+ CAFs分泌的关键代谢物——乳酸 * 研究对象：A+CTM和A-CTM，以及APCDD1+ CAFs和APCDD1- CAFs。 * 实验方法： 1. 排除其他因子：对A+CTM进行热灭活、蛋白酶K、DNase、RNase处理，发现均不能消除其诱导耐药和AR-V7表达的能力，排除了蛋白质、DNA、RNA等大分子的作用。 2. 代谢组学分析：对A+CTM和A-CTM进行非靶向和靶向代谢组学分析。同时对APCDD1+ CAFs和APCDD1- CAFs细胞本身进行代谢组学分析。 3. 乳酸测定：使用乳酸测定试剂盒定量不同条件培养基中的乳酸水平。 4. 乳酸功能验证：直接使用乳酸处理癌细胞和类器官，评估其对恩杂鲁胺敏感性和AR-V7表达的影响。在共培养体系中，通过频繁更换培养基以降低乳酸浓度，观察耐药表型是否逆转。 * 关键发现：代谢组学分析一致显示，A+CTM以及APCDD1+ CAFs细胞本身，其糖酵解相关代谢物显著富集，其中乳酸是上调最明显的代谢物。乳酸测定证实APCDD1+ CAFs向培养基中分泌的乳酸水平显著高于其他组。功能实验表明，外源性乳酸处理足以诱导癌细胞和类器官产生AR-V7并赋予恩杂鲁胺耐药性。频繁更换共培养体系培养基（降低乳酸积累）可恢复癌细胞对恩杂鲁胺的敏感性。
流程四：阐明乳酸调控AR剪接的分子机制——SNRPA蛋白K123位点的乳酸化 * 研究对象：经A+CTM或乳酸处理的前列腺癌细胞。 * 实验方法： 1. 排除能量供应角色：通过Seahorse细胞能量代谢分析仪检测发现乳酸处理增强了癌细胞的氧化磷酸化，但使用氧化磷酸化抑制剂罗滕奈尔并不能逆转A+CTM诱导的耐药或AR-V7表达。 2. 蛋白质翻译后修饰筛选：Western Blot检测发现，A+CTM或乳酸处理特异性上调了细胞整体的蛋白质乳酸化水平，而非其他常见修饰。 3. 乳酸化蛋白质组学：对A+CTM和A-CTM处理的C4-2细胞进行乳酸化修饰组学分析，筛选差异乳酸化蛋白。 4. 关键蛋白鉴定：通过小干扰RNA敲低乳酸化组学中上调最显著的前5个蛋白，发现只有敲低SNRPA能逆转A+CTM诱导的恩杂鲁胺耐药和AR-V7表达。 5. 乳酸化位点鉴定：结合生物信息学预测和质谱分析，在SNRPA蛋白上鉴定出K96、K98、K123三个潜在的乳酸化位点。通过构建点突变质粒（将赖氨酸突变为精氨酸，K->R）和免疫共沉淀实验，证实K123是关键的乳酸化位点。 6. 功能挽救实验：在敲低内源性SNRPA的细胞中，回补表达野生型SNRPA或K123R突变体。结果表明，K123R突变完全阻断了乳酸诱导的AR-V7表达和恩杂鲁胺耐药。 7. 机制探索实验： * RNA结合实验：通过RNA免疫沉淀和RNA pull-down实验，证明乳酸处理增强了SNRPA与外显子剪接增强子基序的结合。 * 染色质结合实验：通过染色质免疫沉淀实验，证明乳酸处理增强了SNRPA在AR基因附近预测结合区域的染色质招募，同时RNA聚合酶II在该区域的招募也增加。 8. 寻找乳酸转移酶：通过免疫共沉淀实验，发现SNRPA与氨酰-tRNA合成酶AARS1存在直接相互作用。敲低AARS1能消除乳酸诱导的SNRPA K123乳酸化、AR-V7表达及恩杂鲁胺耐药。 * 关键发现：乳酸并非主要通过提供能量，而是通过诱导蛋白质乳酸化来发挥作用。SNRPA是介导乳酸效应的关键蛋白，其在K123位点的乳酸化对于其功能至关重要。乳酸化增强了SNRPA与pre-mRNA上顺式作用元件以及染色质的结合能力，从而促进AR基因的可变剪接，产生AR-V7。
流程五：揭示恩杂鲁胺诱导APCDD1+ CAFs产生乳酸的信号通路 * 研究对象：经恩杂鲁胺处理的APCDD1+ CAFs和APCDD1- CAFs。 * 实验方法： 1. 转录组学分析：对恩杂鲁胺处理后的两种CAF进行RNA测序，分析差异表达基因和富集通路。 2. 信号通路抑制：使用PI3K/AKT通路抑制剂（PI3K-AKT-in-1）或受体酪氨酸激酶抑制剂处理APCDD1+ CAFs，通过Western Blot检测通路蛋白（PI3K, p-AKT, p-mTOR, HIF-1α, LDHA）表达，并测定其条件培养基中的乳酸水平及对癌细胞耐药的影响。 3. 体内验证：在共注射模型中，给予PI3K/AKT抑制剂，观察对肿瘤生长和恩杂鲁胺耐药的影响。 * 关键发现：转录组学显示，恩杂鲁胺处理后，APCDD1+ CAFs中PI3K/AKT、HIF-1α和糖酵解通路显著上调。抑制PI3K/AKT通路可下调HIF-1α和LDHA的表达，减少乳酸分泌，并使其条件培养基丧失诱导AR-V7和耐药的能力。体内实验证实了该通路的功能重要性。进一步研究发现，胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）的激活是驱动此通路的上游事件。
流程六：探索靶向乳酸转运的治疗潜力 * 研究对象：激素敏感性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌临床组织样本，以及细胞和动物模型。 * 实验方法： 1. 临床相关性分析：通过免疫荧光检测临床组织中单羧酸转运蛋白1和MCT4在癌细胞和CAF中的表达，并与患者生存期进行关联分析。 2. 药物抑制实验：使用MCT1/4双重抑制剂7ACC1处理癌细胞，评估其对A+CTM诱导耐药的逆转效果。 3. 基因干预实验：在APCDD1+ CAFs中敲低LDHA，评估其条件培养基对癌细胞耐药性的影响。 4. 体内治疗实验：在异种移植模型中，评估7ACC1或与敲低LDHA的CAFs共注射对恩杂鲁胺疗效的增强作用。 * 关键发现：在CRPC组织中，癌细胞MCT1和CAF中MCT4的表达均上调，且高表达与患者不良预后相关。药理学抑制MCT或基因敲低CAF中的LDHA，均能有效逆转APCDD1+ CAFs所介导的恩杂鲁胺耐药，在体内外模型中证实了疗效。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究的结果环环相扣，逻辑链条清晰： 1. 发现耐药相关的CAF亚群：单细胞测序首先发现恩杂鲁胺耐药后APCDD1+ CAF亚群的扩增，并将其与患者不良预后关联，提示其可能参与耐药。 2. 证实该CAF亚群的功能：功能实验证明APCDD1+ CAFs能诱导癌细胞产生AR-V7并导致恩杂鲁胺耐药，明确了其促耐药表型。 3. 锁定关键分泌因子：通过排除法和代谢组学，将关键因子锁定为乳酸，并验证了乳酸足以模拟CAF的促耐药作用。 4. 阐明乳酸的分子作用机制：研究发现乳酸的作用不依赖于其作为能量底物，而是通过诱导SNRPA蛋白的K123位点乳酸化，进而增强SNRPA的RNA和染色质结合能力，最终促进AR基因的可变剪接生成AR-V7。同时找到了催化此修饰的乳酸转移酶AARS1。 5. 解析CAF产生乳酸的上游信号：揭示了恩杂鲁胺通过激活APCDD1+ CAFs中的IGF1R/PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α/LDHA信号轴，驱动其糖酵解和乳酸分泌。 6. 提出并验证治疗策略：基于上述机制，提出靶向乳酸转运是可行策略。临床数据支持MCTs的预后价值，临床前实验证明抑制MCT或LDHA能有效克服恩杂鲁胺耐药。
每一步的结果都自然地引导出下一个科学问题，并通过精心设计的实验进行验证，最终构建了一个从治疗压力（恩杂鲁胺）到基质细胞代谢重编程（CAF产生乳酸），再到癌细胞表观遗传/转录后调控（SNRPA乳酸化→AR可变剪接），最终导致治疗抵抗（恩杂鲁胺耐药）的完整通路。
五、 研究结论与意义
结论：本研究系统性地揭示了一个全新的代谢-表观遗传调控轴，用以解释前列腺癌中去势抵抗的发生机制。具体结论为：恩杂鲁胺治疗压力驱动肿瘤微环境中特定的APCDD1+ CAF亚群通过IGF1R/PI3K/AKT/HIF-1α信号轴发生代谢重编程，大量分泌乳酸。癌细胞通过上调MCT摄取乳酸，乳酸进而诱导剪接体核心组分SNRPA在K123位点发生乳酸化修饰。此修饰增强了SNRPA识别剪接位点和结合染色质的能力，从而促进AR基因的可变剪接，导致AR-V7高表达，最终赋予癌细胞恩杂鲁胺耐药性。
价值： 1. 科学价值： * 深化对“逆瓦博格效应”功能的理解：首次将基质细胞来源的乳酸与癌细胞的关键转录后调控事件（可变剪接）直接联系起来，阐明了在低糖酵解肿瘤中基质代谢重编程促进进展的具体分子路径。 * 拓展乳酸的功能图谱：发现了乳酸通过修饰剪接体蛋白调控可变剪接的全新功能，将乳酸的作用从免疫调节、能量供应延伸至RNA加工层面。 * 揭示代谢物调控可变剪接的新机制：提供了代谢物（乳酸）通过翻译后修饰（乳酸化）直接影响剪接体功能，进而决定特定基因剪接模式的范例。 * 丰富对AR-V7调控机制的认识：除了已知的基因组改变、转录因子等，本研究指出肿瘤微环境代谢物是调控AR-V7产生的重要外部因素。