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CRBN相互作用组图谱揭示分子胶新靶点：高通量蛋白质组学与结构生物学研究
一、作者与发表信息
本研究由来自Dana-Farber癌症研究所、哈佛医学院、Broad研究所及斯坦福大学等多个机构的团队完成，通讯作者为Eric S. Fischer和Katherine A. Donovan，第一作者包括Kheewoong Baek和Rebecca J. Metivier等。研究成果于2025年发表在*Nature Communications*（DOI: 10.1038/s41467-025-62099-w）。
二、学术背景
研究领域：靶向蛋白质降解（Targeted Protein Degradation, TPD）与分子胶（Molecular Glue）药物开发。
研究动机：尽管分子胶（如沙利度胺衍生物IMiDs）在血液肿瘤治疗中表现出色，但其靶点发现长期依赖表型筛选，且已知靶点仅约50个，远低于理论预测的潜在靶点数量（>2500个）。CRBN（Cereblon）作为E3泛素连接酶CRL4CRBN的底物受体，其分子胶诱导的“隐藏相互作用组”仍未被系统探索。
科学问题：如何高通量、无偏地鉴定CRBN分子胶的新靶点？如何区分直接结合与间接招募的蛋白？
研究目标：
1. 开发一种基于细胞裂解物的高通量亲和蛋白质组学工作流程；
2. 绘制CRBN分子胶的全局相互作用图谱；
3. 通过计算与实验验证新靶点，并开发选择性分子胶先导化合物。
三、研究流程与方法
1. 高通量亲和蛋白质组学工作流程开发
- 研究对象：MOLT4和Kelly细胞系（表达谱互补，覆盖已知CRBN底物如IKZF1/3和SALL4）。
- 关键创新：使用活性缺陷型CRBN-DDB1ΔB（缺失Cul4结合域）防止靶蛋白泛素化，保留复合物稳定性。
- 实验设计：
- 在细胞裂解物中加入重组Flag-CRBN-DDB1ΔB和分子胶（如泊马度胺Pomalidomide或异双功能降解剂SB1-G-187）；
- 通过Flag抗体免疫沉淀富集复合物，结合非标记定量蛋白质组学（LFQ）鉴定靶点；
- 自动化样本处理（Opentrons OT-2平台）提升通量，采用DIA-PASEF质谱技术提高灵敏度。
2. 分子胶靶点库构建
- 化合物库：20种IMiD类似物，包括FDA批准药物（如沙利度胺）、临床候选分子（如CC-90009）及新型支架化合物。
- 数据分析：
- 筛选标准：Fold Change >1.5，p<0.001； - 通过“富集频率”评估靶点置信度（如PATZ1在>20次独立实验中富集）。
3. 计算与结构验证
- G-loop数据库构建：
- 使用AlphaFold2预测的蛋白质结构，通过MASTER算法比对已知底物CSNK1A1的β-发夹结构（含Gly的8残基环，G-loop）；
- 计算靶蛋白与CRBN的碰撞分数（Clash Score），过滤>200的冲突结构。
- 冷冻电镜验证：
- 解析FPFT-2216-CRBN-DDB1ΔB与PPIL4/PDE6D的复合物结构（分辨率3.4 Å），确认G-loop结合模式。
4. 靶向筛选与先导化合物优化
- 靶点选择：非锌指蛋白PPIL4（RNA识别模体RRM家族）；
- 筛选策略：
- 通过TR-FRET（时间分辨荧光能量转移）筛选6000种IMiD类似物；
- 发现选择性分子胶Z6466608628（EC50=0.34 μM），并通过IP-MS验证其特异性。
四、主要结果
1. 扩展的CRBN相互作用组
- 鉴定298个CRBN分子胶靶点（270个为新发现），涵盖C2H2锌指转录因子（14%）、RRM蛋白（13%）及激酶（如IRAK1、TBK1）。
- 发现非降解型靶点（如ASS1、ZBED3），提示分子胶可能具有降解非依赖的功能调控作用。
2. 结构机制解析
- 冷冻电镜显示FPFT-2216通过三唑和甲氧基噻吩基团与PPIL4的Arg273相互作用，揭示化学修饰可增强选择性。
- G-loop比对验证了162个靶点的直接结合潜力，冲突分数与实验数据高度一致（如DTWD1经Rosetta松弛后冲突分数从198降至1.58）。
3. 先导化合物开发
- Z6466608628对PPIL4的选择性显著高于FPFT-2216（仅招募PPIL4及其结合伴侣DHX40），为剪接体调控提供新工具。
逻辑衔接：
- 蛋白质组学发现靶点 → 计算过滤G-loop兼容性 → 结构验证结合模式 → 功能化合物筛选，形成闭环研究链条。
五、结论与价值
科学意义：
1. 揭示了CRBN分子胶靶点的多样性，突破了对锌指蛋白的传统认知；
2. 提出“非降解型分子胶”概念，拓展了药物作用机制的理解。
应用价值：
1. 提供公开数据库（https://v2.dfci-fischerlab.com/），助力靶点发现；
2. 工作流程可推广至其他E3连接酶或异双功能降解剂研究。
六、研究亮点
1. 方法创新：首次将活性缺陷型CRBN与自动化IP-MS结合，实现高通量、低背景的靶点筛选；
2. 资源贡献：发布全球最大的CRBN分子胶靶点库（298个），含结构预测与实验验证数据；
3. 转化突破：发现PPIL4选择性降解剂，为颅内动脉瘤等疾病提供潜在治疗策略。
七、其他价值
- 揭示了间接招募现象（如Rab28通过PDE6D/Znf653复合物结合CRBN），提示需区分直接与间接靶点；
- 开源算法（如G-loop冲突评分）可应用于其他E3-配体系统的靶点预测。
（全文约2000字）