本文介绍一项发表于《Microchemical Journal》期刊179卷（2022年，文章号107467）的研究成果。该项研究由来自伊朗马什哈德医科大学（Mashhad University of Medical Sciences）多个研究中心的多位研究者合作完成，第一作者为Kobra Salimiyan Rizi和Behnaz Hatamluyi（并列第一），通讯作者为Majid Rezayi。研究团队涉及抗菌素耐药性研究中心、医学毒理学研究中心、药理学系以及医学生物技术与纳米技术系等多个学术机构。该研究于2022年4月12日在线发表，致力于开发一种新型、高灵敏、快速且无需进行复杂的聚合酶链式反应预扩增的检测技术，用于诊断结核病。
一、 学术背景与研究目标
结核病（Tuberculosis， TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， M.tb）引起的一种严重传染病，是全球十大死因之一。世界卫生组织制定了到2035年将结核病发病率和死亡率分别降低90%和95%的目标。实现这一目标的关键在于早期、准确的诊断。然而，传统的诊断方法，如胸部X光、培养法和痰涂片镜检，存在特异性差、耗时长、灵敏度低等缺点。新兴的分子检测技术，如实时PCR，虽然可靠，但通常需要昂贵设备、专业操作和较长的时间。因此，开发一种快速、准确、灵敏且经济的床边诊断（point of care）技术对于结核病的防控至关重要。
电化学生物传感器因其检测快速、灵敏度高、选择性好、操作简单、使用寿命长等优点，在疾病诊断领域受到广泛关注。但其发展面临提高灵敏度、降低检测限的挑战。纳米材料由于其高比表面积和优异的电子传导性能，为构建新一代高灵敏生物传感器提供了可能。MXenes是一类新兴的二维过渡金属碳/氮化物材料，自2011年被发现以来，因其高金属导电性、良好的生物相容性、大比表面积和易于功能化等特点而备受关注。另一方面，导电聚合物，如聚吡咯（Polypyrrole， PPy），以其稳定的电化学性能、高灵敏度和选择性，在生物传感领域展现出巨大潜力。将MXene与聚吡咯结合，有望协同增强生物传感器的信号响应。
在遗传标记方面，结核分枝杆菌复合体基因组中的IS6110插入序列因其高度保守且在单个细菌基因组中具有多拷贝（可达20个），被广泛视为检测的金标准遗传标记。
基于上述背景，本研究旨在开发一种基于二维Ti3C2 MXene与聚吡咯纳米复合材料修饰电极的无PCR电化学基因传感器，用于直接、高灵敏、高选择性地检测临床样本（特别是痰液样本）中的结核分枝杆菌复合体特异性DNA序列。研究目标包括：1）合成并表征Ti3C2 MXene及其与聚吡咯的纳米复合材料；2）利用密度泛函理论模拟解释材料与DNA探针之间的相互作用；3）构建并优化基因传感器平台；4）评估传感器的分析性能（线性范围、检测限、选择性、重现性）；5）验证传感器在真实临床痰液样本中的应用能力。
二、 研究工作的详细流程
本研究包含从材料合成、表征、传感器构建、性能优化到实际样本检测等一系列严谨的实验流程。
第一步：生物信息学设计与DNA序列准备。 研究选择结核分枝杆菌H37Rv菌株（NCBI登录号：NC_000662.2）IS6110序列中第611至632位核苷酸作为探针序列（P-IS6110：5‘- CAAAGTGTGGCTAACCCTGAA-3’）。同时设计了完全互补的目标序列（T-IS6110）、含有2个和5个错配碱基的序列（2M-DNA， 5M-DNA）以及完全不互补的序列（NC-DNA），用于后续特异性评估。所有寡核苷酸序列均通过商业途径获得。
第二步：Ti3AlC2 MAX相与Ti3C2 MXene的合成与表征。 首先，采用真空热压法，以TiC、Ti和Al粉末按2：1：1.2的摩尔比混合，球磨后在1150°C下烧结3小时，合成了Ti3AlC2 MAX相前驱体。然后，使用HCl和LiF的混合溶液作为蚀刻剂，在35°C下对Ti3AlC2进行48小时的化学蚀刻，成功剥离出多层Ti3C2 MXene。通过多次离心清洗直至上清液pH约为6，然后干燥得到最终产物。 表征方法：利用X射线衍射仪（XRD）分析物相结构，结果显示蚀刻后MAX相的特征峰消失，出现了MXene的（002）峰向低角度移动的特征，证实了成功剥离。场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像显示了MAX相的块状结构和MXene的层状堆叠形貌。能量色散X射线光谱（EDX）证实了MAX相中含有Ti、Al、C元素，而MXene中Al含量显著降低，表明Al层被成功蚀刻移除。
第三步：PPy/MXene修饰电极的制备与表征。 将玻碳电极（GCE）经氧化铝粉末抛光、超声清洗后，在其表面滴涂MXene分散液（4 mg/mL），干燥得到MXene/GCE。然后，采用循环伏安法（CV），在含有0.02 M吡咯单体的磷酸盐缓冲盐水（PBS， pH 7.4）中，于-0.5 V至 +0.1 V（vs. Ag/AgCl）电位窗口内，以50 mV/s的扫描速率循环扫描15圈，在MXene/GCE表面电沉积聚吡咯，形成PPy/MXene/GCE修饰电极。 表征方法：FE-SEM显示，电沉积PPy后，MXene纳米片被一层致密、均匀、无孔的PPy层包裹。动态光散射和Zeta电位分析表明PPy/MXene纳米复合物的平均粒径约为100 nm，Zeta电位约为-40 mV，表明其在水相中具有良好的分散稳定性。电化学表征使用[Ru(NH3)6]³⁺/²⁺作为氧化还原探针进行CV测试，结果显示PPy/MXene/GCE的氧化还原峰电流显著高于裸GCE，表明复合材料显著提高了电极的导电性和电化学活性面积（计算得出从裸GCE的0.24 cm²增加到0.41 cm²）。
第四步：DNA固定化、杂交与电化学检测流程。 将制备好的PPy/Mxene/GCE浸入含有500 nM DNA探针和500 μM亚甲蓝（MB）的PBS（pH 7.0）溶液中，在室温避光条件下孵育90分钟。MB作为氧化还原指示剂，可通过嵌入作用或静电作用与单链DNA探针结合。随后，用PBS洗涤电极以去除未结合的探针和MB分子。接着，用1%牛血清白蛋白（BSA）溶液孵育30分钟，以封闭电极表面的非特异性结合位点。再次洗涤后，将修饰电极浸入含有不同浓度目标DNA的PBS溶液中，在59.4°C下孵育30分钟进行杂交反应。杂交完成后，洗涤电极以去除未杂交的DNA分子。 检测原理与实验：采用差分脉冲伏安法（DPV）在-0.4 V至 -0.1 V电位范围内检测MB的氧化还原峰电流。基于“信号关闭”策略：当目标DNA与探针DNA杂交形成双链DNA后，MB与双链DNA的相互作用减弱或空间位阻增大，导致其电化学信号（峰电流）降低。目标DNA浓度越高，杂交形成的双链越多，MB信号降低越显著。
第五步：理论计算研究。 采用密度泛函理论（DFT）对MXene、PPy、DNA探针（P-IS6110）以及它们的复合物（MXene-PPy， MXene-PPy-P-IS6110）的几何结构、电子性质和相互作用进行了模拟计算。计算优化了各体系的几何构型，绘制了静电势（ESP）图，计算了最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）能隙。结果表明，MXene-PPy杂化体系比单一的MXene或PPy具有更高的HOMO能级和更有效的电荷转移能力。ESP图显示，P-IS6110探针通过其带正电的氨基基团与带负电的MXene-PPy杂化材料表面发生强烈的静电相互作用，从而稳定结合。这些理论结果从原子层面解释了MXene-PPy复合材料作为DNA探针载体的优越性及其增强电化学传感响应的机理。
第六步：分析条件优化。 为了获得最佳的检测性能，研究系统优化了多个关键参数：1）探针浓度：在250 nM至1000 nM范围内测试，750 nM时获得最大MB信号。2）探针固定化时间：30至120分钟，90分钟时信号达到峰值。3）杂交溶液pH：6.0至8.0，pH 7.0时信号最强。4）杂交时间：15至60分钟，30分钟为最佳。所有优化实验均通过DPV监测MB峰电流的变化来确定。
第七步：实际临床样本检测。 为了验证传感器的实际应用能力，研究使用了结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）、非结核分枝杆菌（M. simiae）以及3份经传统PCR验证的人痰液临床样本（2份阳性，1份阴性）。痰液样本经过标准的消化-去污染预处理和基因组DNA提取步骤。提取的基因组DNA经过热变性和快速冷却处理，使其成为单链状态，然后直接用于传感器的检测，无需PCR扩增。同时，进行了加标回收实验，将已知浓度的H37Rv全基因组DNA添加到稀释的健康人痰液基质中，评估传感器的准确度和精密度。
三、 主要研究结果
材料表征结果：XRD、FE-SEM、TEM和EDX数据一致证实了Ti3C2 MXene的成功合成。其层状结构和元素组成符合预期。PPy/MXene复合材料的形貌和电化学表征证实了PPy均匀覆盖在MXene表面，且复合材料显著提升了电极的导电性，为高灵敏检测奠定了基础。
理论计算结果：DFT计算清晰地展示了MXene、PPy和DNA探针之间的相互作用模式。MXene-PPy杂化体系的HOMO-LUMO能隙计算值为126.3 kcal/mol，高于单独的MXene（94.3 kcal/mol）和PPy（105.9 kcal/mol），表明杂化体系更稳定，且具有更高效的电荷转移能力。ESP分析显示杂化材料表面负电荷分布与DNA探针正电荷区域互补，这为探针的牢固固定和后续高效的电子传递提供了理论依据。
传感器分析性能结果：在最优条件下，该传感器对人工合成的目标DNA序列表现出优异的分析性能。DPV结果显示，MB的峰电流强度与目标DNA浓度的对数在100 fM至25 nM的宽范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为Ip （μA） = -1.5565 log C + 3.2508，相关系数R² = 0.9909。根据信噪比3倍标准偏差计算出的检测限（LOD）低至11.24 fM，定量限（LOQ）为37.09 fM。传感器灵敏度高达21.92 μA nM⁻¹ cm⁻²，响应时间为10秒。使用三支独立制备的电极对同一浓度（0.3 nM）目标DNA进行检测，相对标准偏差（RSD）为6.05%，显示了良好的重现性。
选择性评估结果：传感器展现出卓越的选择性。当暴露于完全互补序列（T-IS6110）时，MB信号下降最显著。对于含有2个和5个错配碱基的序列，信号下降程度依次减小，而完全不互补的序列（NC-DNA）引起的信号变化微乎其微。此外，传感器能有效区分结核分枝杆菌H37Rv与高度相似的细菌物种，如牛分枝杆菌BCG和M. simiae的全基因组DNA，对H37Rv的响应信号明显更低，表明其特异性杂交发生在IS6110序列上。
临床样本检测结果：传感器成功应用于真实痰液样本的检测。两份PCR验证为阳性的痰液样本在传感器上产生了显著的MB信号降低，而阴性样本则没有。检测结果与常规PCR方法和琼脂糖凝胶电泳结果完全一致。加标回收实验进一步证明了其在复杂生物基质中的可靠性：在痰液样本中添加不同浓度（0.0001 nM 至 10 nM）的H37Rv全基因组DNA，测得的回收率在90.52%至100.8%之间，RSD在1.034%至4.011%之间，表明传感器具有高的准确度和精密度。
四、 研究结论与价值
本研究成功开发并验证了一种基于PPy/MXene纳米复合材料的新型无PCR电化学基因传感器，用于高灵敏、高选择性地检测结核分枝杆菌复合体。该传感器利用IS6110序列作为特异性识别靶标，结合MXene的高导电性和PPy的生物相容性及信号放大能力，实现了对目标DNA的超灵敏检测（LOD = 11.24 fM）。密度泛函理论计算从分子层面阐明了复合材料增强传感性能的机理。传感器在人工序列和真实临床痰液样本中均表现出优异的性能，具有操作简单、检测快速、成本较低、无需复杂仪器和专业PCR扩增等优点。
科学价值：1）首次将MXene-PPy纳米复合材料应用于结核分枝杆菌DNA的直接电化学检测，为构建高性能生物传感界面提供了新策略。2）将DFT理论计算与实验研究相结合，深入揭示了纳米材料-聚合物-生物分子之间的相互作用机制，为理性设计生物传感器提供了理论指导。3）实现了在无需目标预扩增（PCR-free）的条件下对长链基因组DNA中特定序列的高灵敏检测，突破了传统电化学生物传感器对检测限的挑战。
应用价值：该项技术有望发展为一种用于结核病早期筛查和快速诊断的床边检测工具。其高灵敏度允许直接使用处理后的痰液等临床样本进行检测，避免了耗时的培养或复杂的核酸扩增步骤，特别适合于医疗资源有限的地区，对推动世界卫生组织的结核病防控战略具有潜在的重要实践意义。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的发现
研究在优化过程中发现，电沉积吡咯的电位窗口需谨慎选择（-0.5 V 至 +0.1 V），因为Ti3C2 MXene在高于+0.1 V的电位下会发生电化学氧化转化为TiO2，从而影响其性能。这一细节对于基于MXene的电化学器件的制备具有重要的指导意义。此外，研究对比了该传感器与以往报道的其他结核分枝杆菌DNA电化学传感器的性能，在检测限和线性范围方面均展现出优势，突出了本研究的先进性和竞争力。