本研究由Jody C. May、Cody R. Goodwin、Nichole M. Lareau、Katrina L. Leaptrot、Caleb B. Morris、Ruwan T. Kurulugama、Alex Mordehai、Christian Klein、William Barry、Ed Darland、Gregor Overney、Kenneth Imatani、George C. Stafford、John C. Fjeldsted和John A. McLean等人完成。其中，Jody C. May、Cody R. Goodwin、Nichole M. Lareau、Katrina L. Leaptrot、Caleb B. Morris及John A. McLean来自美国范德堡大学化学系、化学生物学研究所及整合生物系统研究与教育研究所；Ruwan T. Kurulugama、Alex Mordehai、Christian Klein、William Barry、Ed Darland、Gregor Overney、Kenneth Imatani、George C. Stafford和John C. Fjeldsted来自美国加利福尼亚州圣克拉拉的Agilent Technologies公司。该研究于2014年1月22日在线发表于*Analytical Chemistry*期刊，文章标题为“气相中生物分子的构象有序性：在原型高分辨率漂移管离子迁移率-质谱仪上测得的氮气碰撞截面”。本文属于单一原创研究，研究内容涉及离子迁移率-质谱联用技术在生物分子结构表征中的应用，聚焦于氮气碰撞截面（CCS）数据库的建立及其与氦气CCS值的比较。

研究的学术背景建立在离子迁移率-质谱（IM-MS）技术快速发展的基础之上。IM-MS是一种利用离子在惰性缓冲气体中迁移时间差异实现二维分离的分析手段，能够同时提供分析物的尺寸、质量和相对丰度信息。在离子迁移率实验中，离子的漂移时间通常被转换为碰撞截面（Collision Cross Section，CCS），这一参数与分子的平均动量转移碰撞面积相关，是描述气相分子尺寸的重要物理量。不同生物分子类别在IM-MS空间中往往遵循类别特异性的迁移率-质量相关趋势，这种趋势可用于分子类别预测。然而，以往大多数商品化IM-MS仪器采用行波电场进行迁移分离，其CCS值需要借助静电漂移管数据进行校准；而许多实验室自建的静电漂移管仪器主要使用氦气作为缓冲气体。由于氮气和氦气在质量、原子自由度和极化率等方面存在显著差异，将氦气CCS值用于校准氮气测量结果可能引入误差。因此，建立高精度、多样化的氮气CCS数据库，并系统比较氮气与氦气CCS之间的差异，对于提高IM-MS结构表征的准确性和推动“全组学”分析具有重要意义。本研究的目的即为在一台新型高分辨率静电漂移管IM-MS仪器上测量氮气CCS值，建立包含四类化学性质不同分子的数据库，并讨论缓冲气体组成对CCS的影响。

在实验流程方面，研究主要分为样品制备、仪器搭建、数据采集和CCS计算四个环节。样品包括四类：季铵盐（TAA盐）、脂质、肽和碳水化合物。季铵盐为四烷基铵盐，烷基链长度从3到18个碳不等，共包含TAA3至TAA18等化合物；脂质来自猪脑或鸡卵提取物，包括鞘磷脂、鞘糖脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺；肽标准品包括MassPREP预消化蛋白混合物及SDGRG、GRGDS等合成肽；碳水化合物包括线性和环状糊精、糖醇以及人乳寡糖等。所有样品均以正离子模式电喷雾电离，进样流速约为10 μL/min。仪器平台为Agilent Technologies公司开发的原型IM-MS系统，由静电漂移管、电动力学离子漏斗和四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）组成。漂移管长度为78 cm，内部由约150个镀金环形电极构成，缓冲气体为高纯氮气，压力维持在约4 Torr，温度约300 K，漂移电压为750至1450 V，对应的E/N比值为7至15 Townsend，处于低场迁移区。离子在漂移区外的飞行时间与漂移电压无关，因此通过测量不同漂移电压下的漂移时间并拟合漂移时间对电压倒数的直线关系，可扣除离子光学和质谱部分的飞行时间，从而得到真实迁移时间。CCS值根据Mason-Schamp方程计算。为保证质量准确性，使用Agilent调谐混合物进行外部质量校准，并在所有样品中加入TAA盐混合物作为内部质量和迁移率校准标准。所有CCS值均为至少6个不同漂移电压下测量的平均值。

研究的主要结果包括一个包含594个氮气CCS值的数据库，覆盖质量范围约150至2200 Da，CCS范围约140至450 Ų。数据库由92个肽、125个碳水化合物、314个脂质和63个TAA盐及其衍生物的CCS值组成，所有分析物均为单电荷离子，其中分子离子63个、质子化离子111个、钠加合离子273个、钾加合离子124个，其余为锂、铷和铯等其他阳离子加合物。所有CCS值的平均相对标准偏差为0.3%±0.1%，每个CCS值平均代表11±4次独立测量，实验总准确度估计优于2%。将TAA盐的CCS值与文献值比较，绝对差异小于1%，多数小于0.5%，验证了测量准确性。将CCS值按化学类别绘制散点图并进行幂律函数拟合，发现四类分子的CCS与质荷比关系均可用y = ax^b描述，r²值在0.949至0.991之间。结果表明TAA盐在相同质荷比下具有最大的CCS值，碳水化合物具有最小的CCS值，肽和脂质占据相似的构象空间区域，但总体上各类别在质荷比超过约1200 Da时能够明显分离。对碳水化合物的亚类分析显示，人乳寡糖、环糊精和线性糊精在构象空间中未形成明显分区，说明这些亚类之间缺乏强的结构差异；而对脂质的亚类分析则发现鞘脂和甘油磷脂在二维IM-MS空间中呈现不同的分布趋势，鞘脂多位于拟合线上方，甘油磷脂则较为分散，说明构象空间分析可以在一定程度上区分更细微的结构类别。进一步比较了本数据库与文献中氦气CCS值的重叠部分，涉及119个共同分析物，包括8个TAA盐、49个脂质、38个肽和24个碳水化合物。结果表明氮气CCS值系统性大于氦气CCS值，TAA盐的平均绝对差为58±3 Ų，脂质为70±4 Ų，碳水化合物为74±8 Ų，肽为73±5 Ų。尽管存在气体种类差异，不同化学类别的整体迁移率-质量趋势在两种气体中保持相似。氦气与氮气CCS的相关性分析显示，各类别的线性拟合斜率均接近1，说明不同化学类别在两种气体中的CCS差异机制具有系统性。然而，绝对CCS差异随质量增加而略有增大，表明氮气中CCS随质量增加的速度略高于氦气，这可能与氮气更强的离子-中性相互作用势有关。

本研究的结论是，氮气CCS数据库展示了四类化学性质不同的分子在气相中的内在堆积效率，从低到高依次为TAA盐、脂质、肽和碳水化合物，其中生物聚合物尤其是碳水化合物表现出最高的气相堆积效率，脂质则因难以形成紧凑的自溶剂化结构而具有较大的CCS值。尽管氮气和氦气在质量、自由度和极化率方面存在显著差异，但基于氮气的生物分子类别趋势与先前基于氦气的观察在定性上一致。研究还指出，氦气与氮气CCS值的相关性在低质量区域可能失效，未来需要在低于200 Da的质量范围内开展更详细的比较研究。从应用角度看，该数据库为复杂生物样品的“全组学”表征提供了结构参考，利用类别特异性的迁移率-质量相关趋势，可以将未知分析物按可能的化学类别进行优先级排序，并分流至脂质、肽、代谢物或聚糖的专用鉴定流程中。此外，研究中使用的IM-MS仪器具有高分辨率和灵敏度，能够常规观察到低丰度的结构和位置异构体，为复杂样品中异构体分析提供了新的可能性。

本研究的亮点包括：首先，提供了目前规模较大且化学类别多样的氮气CCS数据库，覆盖四种分子类别和广泛的CCS与质量范围；其次，使用的高分辨率静电漂移管IM-MS仪器可直接测定CCS值，避免了行波IM-MS需借助校准的局限性；第三，系统比较了氮气与氦气CCS值的差异及其随质量和化学类别的变化规律，揭示了气体极化率对CCS尺度的影响；第四，通过构象空间分析和亚类分析，证明该方法不仅能区分大类生物分子，还能在脂质亚类水平上提供结构信息，但对碳水化合物亚类的区分能力有限。其他有价值的内容还包括：研究中将TAA盐作为内标用于质量和迁移率校准，展现了其在IM-MS实验中的实用性；对CCS计算中非迁移时间的扣除方法和误差传播分析也为类似实验提供了方法学参考。