本文献发表于《Cancer Science》期刊2021年第112卷，题为“DOC-2/DAB2 Interactive Protein Destabilizes c-Myc to Impair the Growth and Self-renewal of Colon Tumor-Repopulating Cells”。该研究由来自武汉大学中南医院消化内科以及湖北省肠病临床医学研究中心及重点实验室的李海鸥、周云娇、王蒙等学者共同完成。研究通讯作者为武汉大学中南医院的刘静教授。研究获得了中国国家自然科学基金、武汉大学及武汉大学中南医院相关项目的资助。
学术背景与目的 结直肠癌是全球第三常见的恶性肿瘤和第二大癌症相关死因，且其在中青年人群中的发病率在过去二十年持续上升。因此，阐明结直肠癌发生发展的分子机制对优化治疗策略至关重要。癌症干细胞样细胞是肿瘤中一小部分具有自我更新、异质性、可塑性、成瘤性和化疗耐药性的细胞亚群，其存在被认为促进了结直肠癌患者的转移、复发和治疗失败。深入了解这类细胞的生物学特征可为结直肠癌的发病机制提供新见解。先前研究中，研究者利用三维软纤维蛋白凝胶培养体系富集到了一类高致瘤性的肿瘤细胞亚群，它们被称为肿瘤再生细胞，在肿瘤起始和再生中发挥关键作用。这类细胞展现出许多癌症干细胞的特征，但又不同于仅依据传统表面标志物分离的干细胞样细胞。
核心转录因子c-Myc对于维持癌症干细胞样表型至关重要，但其在结肠TRCs中的具体作用和调控机制尚不明确。另一方面，DOC-2/DAB2交互蛋白是一种新型的Ras-GTP酶激活蛋白，是一种在多种侵袭性肿瘤中经常下调表达的肿瘤抑制因子。已有研究表明，DAB2IP表达的缺失会增强癌症干细胞样表型，提示其具有抑制癌症干细胞的作用。本课题组前期工作也发现，DAB2IP在结肠TRCs中的下调会促进其在软纤维蛋白凝胶中的克隆生长。然而，DAB2IP调控TRCs生长和自我更新的具体机制有待进一步探索。因此，本研究旨在探索c-Myc在结肠TRCs中的表达及其调控机制，重点关注肿瘤抑制因子DAB2IP如何通过影响c-Myc来抑制TRCs的功能。
详细研究流程 本研究流程设计严谨，从细胞模型构建、功能验证到分子机制探索，层层递进。
第一部分：结肠肿瘤再生细胞模型的建立与特性验证。 研究首先使用三维纤维蛋白凝胶培养系统，从人结直肠癌细胞系HCT116和HT29中富集TRCs。具体方法是将纤维蛋白原溶液与单细胞悬液混合，加入凝血酶后于24孔板中形成凝胶，培养5天后收集细胞。与在培养瓶中贴壁生长的对照细胞相比，凝胶中生长的TRCs形成了球状形态，细胞体更紧凑，细胞骨架张力更松弛。为验证所富集细胞的干性特征，研究进行了以下实验：1）免疫荧光和免疫印迹检测干细胞标志物CD133、CD44和Nanog的表达，发现其在TRCs中显著上调。2）连续传代实验：将培养5天形成的球体消化成单细胞，重新接种到新的纤维蛋白凝胶中进行第二代培养，此过程可重复至第三代。通过计数克隆数和测量克隆大小评估自我更新能力。结果显示，TRCs能够连续传代形成新的球体，且从第一代到第二代克隆大小增加，第三代与第二代相当；克隆数量随着传代次数增加而增多，证明了其长期再生能力。3）免疫印迹检测凋亡相关蛋白：发现TRCs中促凋亡蛋白Bax表达降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加。这些数据共同证实了通过此方法富集的细胞具有TRCs的典型特征。
第二部分：c-Myc在维持结肠TRCs中的关键作用验证。 研究首先检测了TRCs中c-Myc的表达水平。免疫印迹结果显示，与对照细胞相比，TRCs中c-Myc蛋白水平显著升高，但其mRNA水平未发生显著变化。免疫组织化学染色也证实，由TRCs形成的异种移植瘤中c-Myc蛋白表达高于对照细胞形成的移植瘤。为探究c-Myc的功能，研究使用了小干扰RNA在HCT116和HT29细胞中敲低c-Myc表达，随后进行TRC球体形成实验。结果显示，敲低c-Myc后形成的球体数量更少、尺寸更小。同时，免疫印迹分析发现，敲低c-Myc后，干细胞标志物Nanog、CD133和CD44的蛋白表达水平也相应降低。这些结果表明c-Myc对于维持结肠TRCs的干性和增殖能力是必需的。
第三部分：DAB2IP通过下调c-Myc抑制TRC生长和自我更新。 研究首先确认了DAB2IP在TRCs中的表达情况，定量PCR和免疫印迹均显示DAB2IP在TRCs中表达下调。功能上，过表达DAB2IP会显著减少TRC球体的形成数量和大小，而敲低DAB2IP则促进其生长，这与前期研究一致。机制探索方面，研究发现过表达DAB2IP能显著降低HCT116和HT29细胞中c-Myc的蛋白水平，免疫荧光染色也验证了这一点；反之，敲低DAB2IP则会上调c-Myc蛋白。拯救实验显示，在过表达DAB2IP的细胞中同时过表达c-Myc，可以部分逆转由DAB2IP过表达导致的TRC球体形成抑制和生长受限，同时也能挽救Nanog蛋白表达的下调。然而，无论是过表达还是敲低c-Myc，均不改变DAB2IP的表达水平。在动物模型中，TRC来源的异种移植瘤组织显示出低DAB2IP和高c-Myc的表达模式。这些结果提示，DAB2IP至少部分通过负向调控c-Myc来损害TRC的生长和自我更新。
第四部分：DAB2IP促进c-Myc蛋白降解的机制研究。 为明确DAB2IP下调c-Myc的机制，研究首先检测了mRNA水平，发现DAB2IP瞬时过表达仅引起c-Myc mRNA的轻微下降，提示主要调控发生在蛋白质水平。鉴于c-Myc是一种半衰期很短的不稳定蛋白，研究重点关注其翻译后修饰。1）蛋白质稳定性检测（环己酰亚胺追踪实验）：用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞，在不同时间点检测c-Myc蛋白的衰减情况。结果显示，在过表达DAB2IP的细胞中，c-Myc蛋白的降解速度显著快于对照细胞。2）蛋白酶体途径验证：使用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，可以大部分阻断由DAB2IP过表达引起的c-Myc蛋白减少。3）泛素化分析：免疫共沉淀实验表明，过表达DAB2IP增强了c-Myc的泛素化修饰。进一步，使用特异性识别K48连接方式多聚泛素链的抗体进行检测，发现DAB2IP过表达促进了c-Myc蛋白的K48连接型多聚泛素化，这种连接方式通常靶向蛋白进行蛋白酶体降解。这些结果综合表明，DAB2IP通过泛素-蛋白酶体途径破坏c-Myc的稳定性并促进其降解。
第五部分：DAB2IP通过GSK3β/PP2A-B56α磷酸化/去磷酸化级联调控c-Myc稳定性。 c-Myc的降解高度依赖于一个有序的磷酸化过程：首先由糖原合成酶激酶3β在其苏氨酸58位点进行磷酸化，随后蛋白质磷酸酶2A在其丝氨酸62位点进行去磷酸化。B56α是PP2A的一个关键调节亚基，能引导PP2A全酶与双磷酸化的c-Myc结合。研究探索了DAB2IP是否通过此通路发挥作用。1）磷酸化状态检测：免疫印迹显示，过表达DAB2IP导致c-Myc蛋白的S62位点磷酸化水平相对降低，T58位点磷酸化水平相对升高，pS62/pT58比率显著下降，这与c-Myc不稳定性增加的趋势一致。2）B56α的作用：敲低B56α能够挽救由DAB2IP过表达引起的p-c-Myc（S62）下调。免疫共沉淀实验证实，过表达DAB2IP增强了B56α与c-Myc之间的相互作用，但不改变B56α的总表达量。3）GSK3β的激活：过表达DAB2IP下调了GSK3β在S9位点的磷酸化（这是其失活形式），意味着活化的GSK3β增加。使用GSK3β抑制剂LiCl处理，可以逆转DAB2IP过表达细胞中c-Myc T58位点磷酸化的增加和S62位点磷酸化的减少，说明GSK3β的激活是DAB2IP调控c-Myc磷酸化的前提。此外，免疫荧光显示c-Myc主要位于细胞核，而DAB2IP在细胞质和细胞核中均有分布。免疫共沉淀实验证实，在HCT116细胞中内源性DAB2IP与内源性c-Myc存在相互作用，外源性过表达DAB2IP也验证了这一相互作用。这表明DAB2IP可能也通过直接与c-Myc结合来发挥功能。
第六部分：DAB2IP与c-Myc在临床样本中的相关性及预后价值。 研究收集了15对结直肠癌患者的癌组织及配对癌旁正常组织。免疫印迹分析显示，与癌旁组织相比，癌组织中DAB2IP蛋白表达下调，而c-Myc蛋白表达上调。相关性分析表明，DAB2IP与c-Myc的表达呈显著负相关。免疫组织化学染色进一步证实了这种相反的蛋白表达模式。利用公共基因表达数据库进行的基因集富集分析显示，在GSE39582数据集中，低表达DAB2IP的样本与MYC靶基因信号通路的激活显著相关。此外，数据分析发现低DAB2IP表达与结直肠癌患者的远处转移显著相关。更重要的是，基于GSE103479数据集的分析表明，接受5-氟尿嘧啶为基础辅助化疗的患者中，高表达DAB2IP的患者对治疗反应更好，总生存期更长；而低表达DAB2IP的患者则对辅助化疗不敏感。这提示DAB2ip可能作为预测化疗疗效和预后的生物标志物。
主要结论与意义 本研究系统揭示了肿瘤抑制因子DAB2IP在调控结肠肿瘤再生细胞中的新机制。主要结论是：DAB2IP通过激活GSK3β，并促进PP2A-B56α复合物与c-Myc的结合，从而调控c-Myc蛋白T58位点的磷酸化和S62位点的去磷酸化级联反应，最终增强c-Myc的K48连接型多聚泛素化修饰，并经由泛素-蛋白酶体途径促进其降解。c-Myc蛋白水平的降低，进而损害了结肠TRCs的生长和自我更新能力。在临床层面，DAB2IP的表达与c-Myc呈负相关，且低表达DAB2IP与不良预后和化疗耐药相关。
研究的价值与亮点 本研究的科学价值在于：1）阐明了DAB2IP这一重要肿瘤抑制因子在结直肠癌干细胞样细胞调控中的新功能和新机制，将DAB2IP、c-Myc稳定性调控与TRCs的干性维持联系起来，构成了一个清晰的“DAB2ip-c-Myc轴”。2）详细解析了DAB2IP调控c-Myc蛋白稳定性的具体分子路径，涉及GSK3β/PP2A-B56α介导的磷酸化/去磷酸化级联反应和泛素-蛋白酶体降解，机制研究深入。3）研究不仅使用了细胞系模型，还通过临床组织样本分析和公共数据库挖掘，将基础研究发现与临床病理特征、患者预后及治疗反应相关联，增强了研究的转化医学意义，提示DAB2IP可能成为结直肠癌诊断、预后判断乃至预测化疗疗效的潜在生物标志物。
本研究的亮点包括：1）研究目标聚焦于具有高致瘤性和治疗抵抗性的肿瘤再生细胞这一前沿领域。2）实验设计逻辑严密，从表型到机制，从体外到体内，再到临床关联，层层递进，证据链完整。3）采用了包括三维软凝胶培养、连续传代、环己酰亚胺追踪、特异性泛素化检测在内的多种分子与细胞生物学技术。4）发现了DAB2IP与c-Myc之间存在直接的蛋白质相互作用，为机制提供了新的线索。5）通过生物信息学分析，将分子机制与大规模的临床转录组数据联系起来，验证了其临床相关性。