一项基于尿液DNA甲基化检测以辅助膀胱癌早期发现和风险分层的研究报告

主要作者包括来自AnchorDx Medical Co., Ltd的Weimei Ruan、Hong Wang、Jiaxin Chen、Zhixin Liang、Tianliang Hu、Xia Li、Yuanjie Guo、Zeyu Jiang、Zhiwei Chen、Jian-Bing Fan，以及来自中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科的Xu Chen、Ming Huang、Jingtong Zhang、Shizhong Xu、Jian Huang、Tianxin Lin等。该研究于2021年发表在*Clinical Epigenetics*期刊上。

膀胱癌（bladder cancer, BC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是男性癌症死亡的主要原因之一。根据侵袭性和治疗方式，膀胱癌可分为肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive BC, MIBC）和非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive BC, NMIBC），其中NMIBC可进一步分为低-中危NMIBC（low–intermediate-risk NMIBC, LMR-NMIBC）和高危NMIBC（high-risk NMIBC, HR-NMIBC）。目前的非侵入性检测方法灵敏度有限，且缺乏术前风险分层能力。膀胱癌诊断的金标准仍是膀胱镜检查和组织活检，但这些侵入性操作成本高，且对于低级别和早期肿瘤的检出率不足。尿液细胞学检查对高级别肿瘤特异性较高，但对低级别膀胱癌的灵敏度仅为17%。美国FDA批准的尿液检测如NMP22、BTA stat、BTA trak和UroVysion的总体灵敏度为47–76%，但对低级别和Ta期肿瘤的灵敏度仍较低。此外，目前尚无商业化的检测方法可以在术前识别HR-NMIBC或MIBC患者。DNA甲基化是肿瘤发生早期的重要表观遗传调控事件，具有相对一致性和组织特异性，适合作为非侵入性癌症检测的生物标志物。本研究旨在开发并验证一种基于尿液的PCR DNA甲基化检测方法，以提高膀胱癌的检出率并实现术前风险分层。

研究分为三个阶段。第一阶段为标志物表征和二分类模型开发，使用回顾性单中心队列1，共192例尿液样本，其中116例为膀胱癌，76例为非膀胱癌对照。研究基于前期工作中筛选出的22个膀胱癌相关DNA甲基化标志物，开发了一种基于PCR的尿液DNA甲基化检测方法。对队列1中22个标志物的无监督层次聚类分析显示，BC组的整体甲基化水平高于非BC组。单标志物分析显示，WDR8、SLC4A10、ARL5C、AC092805.1和ONECUT2具有较高的检测灵敏度（80.2–82.8%），而VIM、OSTM1、SLC4A10和NID2具有较高的特异性（90.8–98.7%）。通过随机森林建模和相关性分析，去除高度相关的标志物后，最终开发出由ONECUT2和VIM两个标志物组成的检测模型。该模型在队列1中的准确率为85.4%，灵敏度为87.1%，特异性为82.9%，AUC为0.898。

第二阶段为二分类模型在验证队列中的验证。验证队列2为回顾性单中心研究，纳入98例疑似膀胱癌患者，其中59例为BC，39例为非BC。该队列中，双标志物检测模型的准确率为88.8%，灵敏度为88.1%，特异性为89.7%，AUC为0.921。同时，研究还使用了一个前瞻性单中心队列3进行第二次验证，该队列纳入174例血尿患者，其中34例为BC，140例为非BC。在队列3中，该模型的准确率为86.8%，灵敏度为91.2%，特异性为85.7%，AUC为0.935。这些结果表明，双标志物检测模型在不同临床场景下均具有较高的灵敏度和诊断效能。

研究进一步将该检测方法与尿液细胞学和FISH（fluorescence in situ hybridization，荧光原位杂交）检测进行了比较。在队列2中，该检测的整体诊断准确率为88.8%，灵敏度为88.1%，而细胞学分别为61.9%和57.4%，FISH分别为75.0%和71.7%。在队列3中，该检测的诊断准确率为86.8%，灵敏度为91.2%，而细胞学分别为71.0%和51.9%，FISH分别为77.8%和70.4%。尤其值得注意的是，在低级别肿瘤、Ta期肿瘤和NMIBC的检出方面，该检测的灵敏度显著优于细胞学和FISH。例如，在低级别肿瘤中，该检测的灵敏度为66.7–77.8%，而细胞学和FISH仅为0.0–22.2%；在Ta期肿瘤中，该检测的灵敏度为83.3%，而细胞学为22.2–41.2%，FISH为44.4–52.9%。此外，在伴有泌尿生殖系统疾病（如尿路感染、膀胱良性病变、良性前列腺增生等）的患者中，该检测的准确率（88.9–95.8%）也高于细胞学（55.6–70.8%）和FISH（72.2–77.8%）。研究还发现，尿路感染不会对该检测的风险概率产生显著干扰。

第三阶段为三分类风险分层模型的开发与验证。研究利用队列1中22个标志物的甲基化谱，将样本分为非BC、LMR-NMIBC和HR-NMIBC+MIBC三组。通过单标志物分析和随机森林建模，筛选出VIM、OSTM1、SLC4A10、AC092805.1和ONECUT2五个标志物用于风险分层模型。该模型在队列1中的总体AUC为0.881，准确率为78.0%；在队列2中的AUC为0.889，准确率为82.1%。重要的是，该模型在队列2中识别HR-NMIBC+MIBC患者的灵敏度为90.5%，特异性为86.8%。相比之下，尿液细胞学和FISH对HR-NMIBC+MIBC患者的阳性率分别仅为65.0%和82.1%，说明该五标志物模型能够识别出更多被传统检测遗漏的高危患者。

研究结论指出，基于尿液的DNA甲基化检测方法结合双标志物检测模型和五标志物风险分层模型，为膀胱癌的非侵入性系统诊断提供了一种临床可行的检测方案。该检测在早期膀胱癌的检出和术前风险分层方面表现出高灵敏度和高特异性。在血尿人群（膀胱癌患病率约20%）中，检测模型的阴性预测值达到97.6%，可用于排除低风险患者，避免不必要的膀胱镜检查；在疑似膀胱癌患者（患病率约60%）中，检测模型的阳性预测值为92.9%，可用于确认膀胱癌患者，加快诊断和治疗规划。五标志物分层模型可在术前识别HR-NMIBC和MIBC患者，阳性预测值为84.4%，有助于指导诊断和手术规划，如肌肉层的纳入和随机取样。

本研究的亮点包括：该检测方法在低级别肿瘤、Ta期肿瘤和NMIBC的检出灵敏度显著优于现有的尿液细胞学和FISH检测；该检测在伴有泌尿生殖系统疾病的患者中仍保持较高的诊断准确率，且不受尿路感染的影响；该研究不仅开发了二分类检测模型，还开发了三分类风险分层模型，可在术前识别高危患者；与已报道的甲基化检测方法（如NID2和TWIST1组合、BCL2/CDKN2A/NID2组合、HOXA9/PCDH17/POU4F2/ONECUT2组合）相比，本研究的ONECUT2和VIM双标志物模型表现出更高的灵敏度和特异性；五标志物分层模型在识别HR-NMIBC+MIBC方面优于尿液细胞学和FISH，有助于减少高危患者的漏诊。此外，该检测方法与居家尿液自采集装置兼容，尿液样本在2–8°C下可稳定保存5天，有利于在COVID-19疫情期间减少患者就诊次数和实验室对新鲜尿液的处理需求。

总体而言，该研究开发的尿液DNA甲基化检测方法在膀胱癌早期检测和风险分层方面具有显著的临床应用潜力，有望作为常规检测手段改善膀胱癌的诊断和预后管理。