本研究由来自韩国延世大学医学院、延世癌症中心等机构的研究团队，与全球生命科学解决方案公司（Global Life Sciences Solutions）在多个国家（英国、美国、新加坡、中国、韩国）的团队合作完成。通讯作者为Byoung Chul Choi。研究成果以题为“Successful expansion and cryopreservation of human natural killer cell line NK-92 for clinical manufacturing”的论文形式，于2024年2月23日发表在学术期刊《PLOS ONE》上。
本研究的学术领域属于肿瘤免疫治疗与细胞制造工艺学（Cell Manufacturing Process）的交叉领域。研究开展的背景在于，自然杀伤（Natural Killer， NK）细胞作为一种具有广阔前景的肿瘤免疫治疗工具，尤其在治疗血液系统恶性肿瘤方面显示出巨大潜力。然而，当前NK细胞的制造流程存在诸多瓶颈：很大程度上依赖于人工、开放且不连贯的操作；需要饲养细胞或使用研究级试剂；难以实现标准化和规模化。特别地，成功的规模化扩增高度依赖于富含营养的培养基以及能够在冻融后维持高细胞活力和回收率的冷冻保存条件。目前，针对NK-92细胞系这一均质化、可“现货供应”（off-the-shelf）的细胞治疗候选产品，缺乏一个完整的、符合良好生产规范（Good Manufacturing Practice, GMP）、自动化且封闭的扩增与冻存标准化流程。因此，本研究旨在利用市售的GMP级别硬件（如Cytiva的设备）和培养基，建立一个适用于NK-92细胞临床级生产的、可扩展的工作流程模型。具体目标包括：系统优化NK-92细胞的冷冻保存参数（如降温速率、冻存保护剂、细胞浓度、冰晶诱导等）；评估不同培养基在冻融后对细胞稳定性和扩增能力的影响；验证在封闭式生物反应器中大规模扩增NK-92细胞及其基因工程改造变体的可行性。
研究的详细工作流程可分为三大核心部分：冷冻保存条件优化、冻融后细胞功能评估以及封闭式生物反应器规模化扩增验证。首先，在冷冻保存条件优化部分，研究团队以NK-92细胞为研究对象，设计了多因素实验。他们测试了三种不同的冷冻保护剂：含10%二甲基亚砜的CryoStor CS10、无DMSO的CryoSofFree DMSO Free以及无DMSO的Stem-Cell Banker DMSO Free。细胞被冷冻在冷冻管中，使用Via Freeze程序降温仪进行控制速率冷冻，分别设定了-0.5°C/分钟、-1.0°C/分钟和-2.0°C/分钟三种降温速率。此外，实验还考察了手动诱导冰晶成核对细胞存活的影响，即在降温至-10°C时取出冷冻管，通过轻敲管壁诱导结晶。同时，研究了不同细胞浓度（5×10^6、1×10^7、5×10^7 细胞/毫升）对冻存效果的影响。冻存后的细胞在液氮气相中长期储存（1、3、6个月），然后在37°C水浴中快速复苏。细胞活力在复苏后即刻、24小时和72小时通过台盼蓝拒染法进行评估。此外，还将优化后的条件应用于冷冻袋进行放大验证。数据分析采用方差分析和Mantel-Cox对数秩检验，使用GraphPad Prism软件进行。
其次，在冻融后细胞功能评估部分，研究评估了三种不同的培养基（X-VIVO 10、Xuri T Cell Expansion Medium、NK MACS）对复苏后NK-92细胞扩增、形态、存活和功能的影响。复苏后的细胞在T75培养瓶中培养12天，定期计数并评估活力。通过显微镜观察细胞形态和聚集情况。为了评估冻融后细胞的杀伤功能，将NK-92细胞与K562靶细胞以不同效靶比共培养24小时，使用流式细胞术检测靶细胞的死亡率（7AAD染色）以及NK-92细胞效应分子（如CD107a、穿孔素、颗粒酶B、TNF-α）的表达水平。同时，也对比了Xuri培养基和X-VIVO 10培养基在长期培养过程中对细胞表面激活受体、效应分子和抑制受体表达谱的影响。此外，研究还扩展到了两种基因工程改造的NK-92细胞变体：表达Fc受体（CD16）的CD16-NK-92细胞和表达T细胞受体（TCR）的TCR-NK-92细胞，以验证优化后的培养基对这些工程化细胞扩增效率的支持能力。
第三，在封闭式生物反应器规模化扩增验证部分，研究采用了Cytiva的Xuri W25波浪式生物反应器系统。研究比较了2升和10升规模的细胞培养袋。工作流程如下：首先在T75培养瓶中手动扩增获得足够数量的种子细胞（如1×10^8或2.5×10^8个细胞），然后接种到生物反应器袋中。系统参数设置为：温度37°C，pH 7.2-7.4，二氧化碳浓度5%，空气流量0.1升/分钟，摇动速度6转/分钟，摇动角度2°。培养初期通过补液维持细胞密度在2.5×10^5细胞/毫升，直至达到培养袋的最大工作体积（1升或5升）。当细胞密度达到0.5-1.0×10^6细胞/毫升时，通过灌注管路更换一半培养基。达到最大体积后，采用两种方法进行培养：方法一使用系统连续灌注功能（每天更换50%体积的培养基）；方法二采用半量换液（每隔几天完全更换一半体积的培养基）。在整个培养过程中，每隔一天取样进行细胞计数和活力检测，评估扩增效率。实验重复了三次以验证可重复性。培养结束后，同样使用流式细胞术分析扩增后细胞表型的稳定性。
研究取得了一系列系统性的结果。在冷冻保存优化方面，关键的发现包括：1. 降温速率：对于NK-92细胞，-1.0°C/分钟的降温速率是最佳的，在该速率下，三种冻存保护剂均显示出较好的细胞存活率。特别是无DMSO的Stem-Cell Banker在-1.0°C/分钟条件下表现出最高的存活和恢复趋势。而-2.0°C/分钟的速率对CryoStor CS10和CryoSofFree不利，但对Stem-Cell Banker影响较小，提示后者可能允许更快的脱水过程。2. 冰晶诱导：在-1.0°C/分钟下，手动诱导冰晶成核（在-10°C）显著提高了细胞复苏后72小时的活力，表明控制结晶过程对减轻低温损伤有益。3. 细胞浓度：在高达5×10^7细胞/毫升的浓度下冻存，细胞活力没有显著下降，这有利于减少冻存液用量和后续洗涤步骤。4. 长期储存：在液氮气相中储存长达6个月，细胞活力和复苏后的增殖能力未受显著影响，但CryoSofFree组在储存6个月后的增殖能力有所下降。5. 冷冻袋验证：将优化条件（-1.0°C/分钟， Stem-Cell Banker， 5×10^7细胞/毫升）应用于冷冻袋，获得了比冷冻管更高且更稳定的复苏后活力（80-90%），且批次间差异更小。
在冻融后培养评估中，结果明确显示Xuri T Cell Expansion Medium具有显著优势：1. 扩增效率：NK-92细胞在Xuri培养基中复苏后增殖迅速，第9天扩增达11.2倍，远优于X-VIVO 10的4.53倍，而NK MACS培养基则无法支持增殖。2. 细胞形态：在Xuri培养基中，细胞迅速稳定并形成正常集落，而在X-VIVO 10和NK MACS中则观察到明显的细胞聚集，这些聚集体多为死细胞。3. 细胞功能：复苏后在Xuri培养基中稳定培养的NK-92细胞，保持了强大的细胞毒性，在不同效靶比下能有效杀伤K562细胞，并高表达CD107a、穿孔素、颗粒酶B等效应分子。4. 基因工程细胞：Xuri培养基同样能高效支持CD16-NK-92和TCR-NK-92细胞的扩增，在20天的培养期内分别实现了182倍和205倍的扩增，且细胞活力和表型维持良好。
在生物反应器扩增验证中，研究取得了成功：1. 扩增效率与时间：在10升规模的培养袋中，使用优化后的方法（方法二），NK-92细胞仅需8-9天即可实现100倍的扩增，而传统T瓶培养需要20-21天，时间缩短了一半以上。2. 可重复性：三次独立实验均显示出高度一致的扩增曲线，证明了该流程的稳健性。TCR-NK-92细胞在相同条件下也表现出类似的优异扩增能力。3. 表型稳定性：无论使用NK-92还是TCR-NK-92细胞，经过生物反应器大规模扩增后，细胞表面一系列激活受体、效应分子和抑制受体的表达谱均保持稳定，表明扩增过程没有改变细胞的核心身份和功能特性。
基于以上结果，本研究得出结论：成功建立并优化了一套适用于NK-92细胞及其基因工程变体临床级生产的、可扩展的、封闭式工作流程。该流程的核心要素包括：使用无DMSO的Stem-Cell Banker作为冻存保护剂，配合-1.0°C/分钟的精确降温速率和冰晶诱导操作，可实现细胞的高活力长期冻存；采用Xuri T Cell Expansion Medium作为复苏后和扩增期的培养基，能有效防止细胞聚集，促进快速恢复和高效扩增；利用Xuri W25波浪式生物反应器系统，能够实现自动化、封闭式的大规模细胞生产，显著缩短生产周期，并保持细胞产品的表型均一性和功能活性。
本研究的价值体现在多个层面。在科学价值上，它系统性地揭示了影响NK-92细胞冷冻保存效果的关键参数及其相互作用，特别是明确了降温速率、冻存保护剂成分和冰晶控制的重要性，为免疫细胞冻存生物学提供了新的数据。在应用价值上，其意义尤为突出：1. 它为开发“现货供应”型NK细胞疗法产品奠定了关键的工艺基础。通过优化冻存和扩增流程，使得大规模生产、长期储存、按需使用的“现货”模式成为可能，克服了自体细胞疗法中患者等待时间长、生产地点受限等瓶颈。2. 提供了一套完整的、基于市售GMP级别物料和设备的解决方案，具有高度的可转化性和可重复性，有助于推动NK细胞疗法从实验室走向临床和商业化生产。3. 展示了封闭式、自动化生物反应器在免疫细胞制造中的优势，包括提高效率、减少污染风险、增强过程控制和质量一致性，符合先进治疗产品（ATMP）的监管要求。
本研究的亮点在于：1. 系统性优化：并非单一参数测试，而是对冷冻保存和扩增的全流程进行了多因素、系统性的实验设计与优化，涵盖了从冻存到复苏再到大规模扩增的完整链条。2. “无DMSO”方案的优选：在比较多种冻存保护剂后，推荐无DMSO的Stem-Cell Banker作为优选方案，这有助于规避DMSO输注可能带来的潜在毒副作用，提高临床安全性。3. 工艺的封闭性与自动化：成功将手动、开放的实验室流程，升级为在功能封闭的Xuri W25生物反应器中进行的自动化、可监控的工艺流程，这是实现临床级生产的核心进步。4. 对基因工程细胞的普适性验证：研究不仅针对野生型NK-92，还验证了该优化流程对表达CD16或TCR的工程化NK-92细胞同样有效，扩大了其应用范围。5. 数据详实，关注长期功能：评估不仅限于复苏即刻的活力，还深入考察了复苏后72小时的恢复情况、长期储存后的功能以及大规模扩增后的表型稳定性，这些对于细胞治疗产品的质量评估至关重要。
此外，研究中观察到的“细胞聚集”现象及其与培养基选择的相关性，也是一个有价值的发现，提示在细胞治疗工艺开发中，复苏后培养基的筛选对于细胞初始状态和后续扩增至关重要。论文最后也指出，尽管本研究取得了积极成果，但未来仍需在进一步提高扩增倍数、缩短培养时间以及验证更大生产规模（如百升级）等方面进行持续优化，以完全满足商业化“现货”产品的需求。本研究为达成这一目标迈出了坚实的一步。