本研究报告基于发表在《Journal for Immunotherapy of Cancer》2019年的一篇开放获取研究文章，题为“PD-1 signaling affects cristae morphology and leads to mitochondrial dysfunction in human CD8+ T lymphocytes”。该研究由来自西班牙国家生物技术中心、塞维利亚安达卢西亚生物信息学中心、马德里自治大学分子生物学中心等机构的Jesús Ogando, María Eugenia Sáez, Javier Santos等作者共同完成，通讯作者为Santos Mañes。本研究属于免疫学与细胞代谢交叉领域的前沿探索。
学术背景与研究目的 程序性死亡受体1与其配体的结合会传递抑制性信号，导致T细胞耗竭。阻断PD-1/PD-L1通路已成为癌症免疫治疗的重要手段，并取得了显著疗效。然而，PD-1在T细胞内传导的具体抑制信号机制，尤其是其对T细胞功能影响的深层分子基础，仍不甚明了。尽管已知PD-1参与调节T细胞代谢，例如抑制糖酵解，但其影响线粒体功能的机制在很大程度上仍是未知的。先前研究提示，线粒体功能和完整性对于T细胞的分化和功能至关重要，而肿瘤微环境可抑制T细胞的线粒体生物合成。因此，阐明PD-1信号如何具体重塑CD8+ T细胞的代谢，特别是线粒体功能与结构，对于深入理解T细胞耗竭机制、优化现有免疫疗法并开发新的联合治疗策略具有重大科学意义。本研究的核心目的，正是为了探究PD-1结合所触发的特异性信号通路，明确其如何导致CD8+ T细胞功能失调，并特别聚焦于PD-1信号对线粒体代谢、超微结构及功能的影响。
详细研究流程 本研究设计了一套严谨、多层次的研究方案，系统地揭示了PD-1信号对人类CD8+ T细胞的转录组、代谢表型和线粒体结构的深刻影响。主要流程如下：
细胞模型构建与PD-1刺激系统： 研究从健康供体外周血中通过负选分离出纯化的人CD8+ T细胞。为了模拟T细胞受体与PD-1同时被 engagement 的情境，研究者设计了一种磁珠刺激系统。具体分为三组：对照组使用IgG1包被的磁珠；激活组使用包被了抗CD3和抗CD28抗体的磁珠；PD-1刺激组则在抗CD3/CD28抗体的基础上，额外包被了PD-L1-Fc融合蛋白。通过流式细胞术检测CD25、CD69和IFN-γ的表达，以及氚标记胸苷掺入实验，验证了该系统中PD-1信号能有效抑制T细胞的活化、效应功能及增殖，且呈剂量依赖性。
转录组学分析： 为了全局性解析PD-1信号触发的基因表达程序，研究者在刺激后6、24和48小时分别收取上述三组细胞的RNA，进行了RNA-seq测序。生物信息学分析流程严谨：使用GEM工具将测序reads比对到人类参考基因组，利用Flux进行基因水平定量。差异表达分析采用DESeq2 R包，并运用似然比检验来识别随时间变化在PD-1刺激组与激活组之间表达模式显著分歧的基因。对筛选出的差异基因，进一步使用STEM软件进行时序聚类分析，并利用Gene Ontology和KEGG数据库进行通路富集分析，以确定PD-1调控的核心生物学过程和信号通路。
细胞代谢功能分析： 基于转录组学提示代谢是PD-1调控的主要靶点，研究者使用Seahorse细胞外通量分析仪进行了深入的代谢表型分析。测量了细胞的糖酵解速率和线粒体呼吸功能。具体包括：基础糖酵解率和酸化率；在葡萄糖作为底物时，测量基础耗氧率、最大呼吸能力、备用呼吸容量和质子漏；此外，特别使用棕榈酸作为底物，在有无肉碱棕榈酰转移酶1A抑制剂埃托莫西存在的情况下，测量脂肪酸氧化依赖的耗氧率，以评估细胞对脂肪酸氧化的依赖性。同时，通过酶学法检测了细胞培养上清中的乳酸产量。
线粒体功能与结构的多维度表征： 这是本研究的重点和亮点部分，采用了多种技术手段：
呼吸链超复合物分析： 鉴于线粒体嵴是呼吸链复合物组装和发挥功能的主要场所，研究者使用蓝绿原生胶电泳技术，分析了线粒体呼吸链超复合物的组装情况。这是一种用于研究膜蛋白天然状态复合物的专门技术，能够直观显示复合物I、III、V等形成的超分子结构。
基因功能验证实验： 为了确立特定基因下调与PD-1诱导的表型之间的因果关系，研究者在原代CD8+ T细胞中进行了基因沉默实验。通过慢病毒载体递送针对 CHCHD3 基因的短发夹RNA，敲低其表达后，再次刺激T细胞，并检测线粒体膜电位和IFN-γ产生能力是否重现了PD-1刺激所导致的缺陷。
主要研究结果 研究结果层层递进，有力地支撑了最终结论。
首先，转录组学分析表明，PD-1 engagement 不仅阻断了T细胞活化，更触发了一个独特且随时间变化的基因表达程序，该程序与静息T细胞不同。通路富集分析明确显示，代谢过程是PD-1调控的最主要途径，其中涉及糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸和核苷酸代谢等多个方面。特别值得注意的是，有84个差异表达基因与线粒体相关，功能涵盖线粒体DNA复制修复、蛋白质输入、嵴结构与组织等。
其次，代谢表型分析证实了转录组的预测。PD-1刺激显著降低了CD8+ T细胞的糖酵解能力（乳酸产量和ECAR下降）和以葡萄糖为底物的线粒体基础呼吸与最大呼吸能力。然而，OCR/ECAR比值在PD-1刺激组中反而高于激活组，提示其相对更依赖氧化磷酸化。更深入的机制研究发现，PD-1刺激细胞的质子漏更低，且脂肪酸氧化依赖的呼吸显著增强，并伴随着脂肪酸氧化关键酶CPT1A的表达上调。这表明PD-1将细胞代谢重编程为高效利用脂肪酸氧化的模式，类似于长寿记忆T细胞的代谢特征。
第三，线粒体功能与结构分析揭示了PD-1信号的深远影响。功能上，PD-1刺激不可逆地降低了线粒体膜电位，但活性氧生成未显著改变。结构上，透射电镜观察到了革命性的发现：与活化T细胞紧密、平行的层状嵴结构相比，PD-1刺激细胞的线粒体嵴数量减少、长度变短，甚至出现大量完全缺失可见嵴的线粒体。这种严重的结构缺陷与两个线粒体接触位点及嵴组织系统关键蛋白CHCHD3和CHCHD10的表达下调相一致。
第四，基因功能验证确立了因果关系。在原代CD8+ T细胞中特异性敲低 *CHCHD3*，足以模拟PD-1刺激的部分效应，即导致线粒体去极化和T细胞再激活后IFN-γ产生能力下降。这直接证明MICOS复合体成分的下调是介导PD-1所致线粒体功能障碍的重要机制。
第五，一个意外的发现是呼吸链超复合物组装分析的结果。尽管PD-1刺激导致严重的嵴结构破坏和呼吸功能抑制，但蓝绿原生胶电泳显示，包含复合物I和III的呼吸链超复合物在PD-1刺激组和静息组中的丰度，反而高于活化T细胞组。研究者推测，这可能是线粒体在应对严重内膜结构紊乱时的一种代偿机制。与此相符，转录组数据显示，负调控超复合物组装的辅伴侣蛋白MCJ/DNAJC15在活化T细胞中表达上调。
研究结论与意义 本研究得出结论：线粒体是PD-1抑制活性的主要靶标。PD-1信号通过触发一个独特的转录程序，不可逆地重编程CD8+ T细胞代谢，使其转向高效的脂肪酸氧化依赖的氧化磷酸化，并同时导致线粒体嵴结构的严重破坏。这种代谢与结构的“重构”，一方面损害了细胞的即时效应功能，另一方面可能赋予了细胞类似记忆表型的长期生存潜力，这为解释肿瘤微环境中PD-1阳性T细胞的特性和功能状态提供了新的机制框架。
本研究的科学价值在于：1) 首次系统揭示了PD-1信号导致人类CD8+ T细胞线粒体嵴形态发生显著改变，并明确了CHCHD3/CHCHD10-MICOS通路在这一过程中的关键作用；2) 超越了“PD-1仅抑制活化信号”的传统观点，证明了PD-1能主动诱导一个独特的、不可逆的代谢与转录重编程程序；3) 将T细胞耗竭、代谢重编程和线粒体超微结构缺陷三者有机地联系起来，为理解T细胞功能障碍提供了更整合的视角。
其应用价值在于：这些发现指出了恢复线粒体功能和嵴结构可能是克服T细胞耗竭、增强抗肿瘤免疫的新策略。靶向CPT1A促进的脂肪酸氧化或干预MCJ等调节超复合物组装的因子，有望与现有的PD-1/PD-L1阻断疗法产生协同作用，为开发下一代肿瘤免疫联合疗法提供了新的潜在靶点。
研究亮点 1. 创新性的发现： 首次在人类CD8+ T细胞中详细描述了PD-1信号引起的线粒体嵴形态学严重缺陷，并将其与特定的分子（CHCHD3/CHCHD10）和复合物（MICOS）下调直接关联。 2. 多层次、系统性的研究设计： 结合了转录组学、代谢组学（Seahorse）、超微结构学（TEM）、蛋白质生化（BN-PAGE）和基因功能验证，构成了完整而坚固的证据链。 3. 对传统观点的修正与深化： 明确提出PD-1的作用不仅仅是阻断活化，更是主动诱导一个独特的、不可逆的代谢重编程程序，使细胞转向一种功能受抑制但可能长生存的状态。 4. 意料之外又情理之中的发现： 在嵴结构破坏的背景下发现呼吸链超复合物组装反而增加，并提出了代偿机制的解释，显示了生物学系统的复杂性，为后续研究打开了新的方向。 5. 强大的临床相关性： 研究所用的系统模拟了T细胞在肿瘤微环境中同时接收TCR激活信号和PD-1抑制信号的状态，其发现对于理解肿瘤浸润淋巴细胞的功能失调具有直接参考价值。