本研究由Gerard Comamala、Camilla C. Krogh、Vibe S. Nielsen、Jörg P. Kutter、Josef Voglmeir和Kasper D. Rand*（通讯作者）团队完成，发表于《Analytical Chemistry》期刊2021年第93卷，页码16330-16340。研究团队来自丹麦哥本哈根大学药学院蛋白质分析组（Protein Analysis Group）和微尺度分析系统组（Microscale Analytical Systems Group），以及南京农业大学的糖科学与糖生物工程研究中心（Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center）。
学术背景
氢氘交换质谱（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry, HDX-MS）是研究蛋白质构象动态和相互作用的重要技术，但对含有翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）（如二硫键和糖基化）的蛋白质分析存在挑战。传统方法需通过化学还原剂（如三(2-羧乙基)膦，TCEP）和溶液中的糖苷酶（如PNGase A或H+）处理，但存在样品处理繁琐、酶消耗量大、且可能影响液相色谱-质谱（LC-MS）性能等问题。本研究旨在开发一种集成电化学还原（Electrochemical Reduction, ER）和微流控芯片固定化糖苷酶（Immobilized Microfluidic Enzyme Reactors, IMERs）的HDX-MS新方法，以解决上述问题。
研究流程
酶活性评估与固定化
- 研究对象：比较三种糖苷酶（PNGase A、H+和新发现的PNGase DJ）在淬灭条件（pH 2.5，0°C）下的活性。
- 实验方法：
- 溶液活性测试：以辣根过氧化物酶（HRP）和曲妥珠单抗（Trastuzumab, TZ）糖肽为底物，通过SDS-PAGE和LC-MS评估酶活性。PNGase DJ和H+显示显著高于PNGase A的活性（PNGase DJ比活性为118 mU/mg，PNGase A仅为0.2 mU/mg）。
- 微芯片固定化：通过硫醇-烯点击化学将酶固定在微流控芯片上，形成IMERs。测试显示PNGase DJ IMERs在重复使用和长期储存后仍保持高效去糖基化能力。
集成化HDX-MS工作流开发
- 研究对象：酪氨酸激酶MET（c-MET）的SEMA结构域（SD c-MET），该蛋白含5个分子内二硫键、2个分子间二硫键和6个未表征的糖基化位点。
- 实验设计：
- 电化学还原（ER）：使用EC 2.0电化学池（铂对电极和钛工作电极）在线还原二硫键，还原效率达96%。
- 在线酶解与去糖基化：依次通过PNGase DJ IMERs（去糖基化）、胃蛋白酶IMERs（蛋白酶解）和反相色谱分离，实现全自动化分析。
- 序列覆盖度优化：与传统TCEP还原法相比，新方法覆盖了SD c-MET α链92.5%和β链81.6%的序列，包括所有二硫键和糖基化区域（除Asn92外）。
应用验证：单克隆抗体（mAb）表位作图
- 实验流程：比较SD c-MET与mAb结合前后的HDX差异，发现结合导致α链145-158、204-215和β链59-66区域的氘交换率显著降低，提示这些区域参与mAb结合。
- 结构意义：通过晶体结构比对（PDB:1SHY），发现204-215区域与c-MET内源性配体HGF的表位部分重叠，暗示mAb可能通过竞争性抑制发挥治疗作用。
主要结果
- 酶性能：PNGase DJ在淬灭条件下活性最高，其IMERs可重复使用且稳定性优异（30天后活性仅下降3倍）。
- 工作流优势：集成ER和IMERs的HDX-MS将SD c-MET序列覆盖度从传统方法的67.5%（α链）提升至92.5%，且检测到糖基化位点（如Asn125）的部分去糖基化肽段。
- 表位定位：mAb结合导致α链145-158和204-215区域的构象稳定化，其中204-215与HGF表位重叠，为药物机制提供了结构依据。
结论与价值
本研究开发了一种创新的HDX-MS工作流，通过电化学还原和微芯片固定化酶技术，实现了对高度糖基化和二硫键连接蛋白质的高效分析。其科学价值在于：
1. 方法学突破：解决了传统HDX-MS对PTM-rich蛋白质分析的技术瓶颈。
2. 应用潜力：为生物制药中抗体表位分析和糖蛋白构象研究提供了新工具，尤其适用于c-MET等复杂靶点的药物开发。
研究亮点
- 新型糖苷酶应用：首次将PNGase DJ用于HDX-MS，其酸稳定性和高活性优于传统酶。
- 集成化设计：ER与IMERs的联用实现了“样品进-结果出”的全自动化分析。
- 结构生物学意义：揭示了mAb与c-MET结合的精确区域，为靶向治疗提供了分子基础。
其他价值
本研究还验证了IMERs的长期稳定性（50天储存后活性稳定），并量化了工作流的背交换率（与常规方法相比增加5.1%-13%），为后续方法优化提供了参考。