本研究报告基于由Wenhui Qian, Bei Zhang, Ming Gao, Yuting Wang, Jiachen Shen, Dongbing Liang, Chao Wang, Wei Wei, Xing Pan, Qiuying Yan, Dongdong Sun, Dong Zhu, Haibo Cheng等作者组成的团队所完成的研究，其主要研究机构包括南京中医药大学药学院、金陵医院药学部（南京大学医学院附属医院）以及江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心。该研究成果于2024年7月31日在线发表于学术期刊*Journal of Pharmaceutical Analysis*上。
本项研究隶属于药学、中药学与生物医学的交叉领域，具体聚焦于利用超分子化学策略阐释中药配伍的现代科学内涵，并开发新型抗炎治疗策略。研究的启动源于一个核心的科学问题：在传统中医药中，诸如黄连-乌梅（Rhizoma Coptidis-Fructus Mume）这样的经典“药对”在临床上展现出的协同增效作用，其背后的精确分子机制是什么？尽管黄连乌梅汤（Huanglian Wumei Decoction, HLWMD）在治疗溃疡性结肠炎、糖尿病等炎症性疾病方面疗效确切，但两味药为何必须配伍使用，以及其确切的抗炎作用机制尚未得到充分阐明。与此同时，持续的炎症反应与多种严重疾病的发生发展密切相关，其中巨噬细胞的过度活化、炎症小体（inflammasome）的激活以及随之发生的细胞焦亡（pyroptosis）是关键的病理环节。目前，能够通过非经典通路（caspase-4/5/11介导）抑制细胞焦亡的药物非常有限。因此，从天然产物中寻找高效、低毒的抗炎成分并阐明其作用机理，具有重要的临床意义。本研究的目标在于：第一，从黄连-乌梅药对的配伍中获取灵感，运用超分子自组装策略，构建一种新型的超分子前药；第二，系统表征该超分子的结构、形成机制及其理化性质；第三，在细胞水平深入探究其抗炎效果及具体作用机制，特别是其对细胞焦亡的抑制作用；第四，从超分子自组装的角度，为中药“配伍”理论的现代科学阐释提供新的思路和实验依据。
研究的工作流程系统而详尽，可分为以下几个关键环节：
首先是超分子纳米粒（Berberine-Chlorogenic Acid Supramolecular, BCS）的发现与制备。研究团队首先采用传统煎煮法制备了黄连乌梅汤（HLWMD）的浓缩液，并通过透析分离出了其中自组装的植物化学成分。初步的透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）、紫外-可见光谱（UV-Vis）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析表明，这些纳米颗粒主要含有黄连的主要活性成分小檗碱（Berberine, BBR）和乌梅的主要活性成分绿原酸（Chlorogenic Acid, CGA）。受此启发，为了深入探究其自组装机制，研究人员采用一步自组装法，在60°C水溶液中，将BBR和CGA以1:1的摩尔比混合并剧烈搅拌，随后调节pH至中性，经透析和冷冻干燥后，成功制备了BCS超分子粉末。
接下来是BCS的结构表征与自组装机制解析。这是本研究的核心化学基础部分。研究运用了多种先进表征技术：1) 形貌与尺寸分析：TEM显示BCS形成了尺寸均一（约98.3 nm）的球形纳米颗粒，纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）和动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）结果与此一致，且Zeta电位为负值，表明其具有良好的稳定性。2) 光谱学分析：UV-Vis光谱证实BCS的吸收峰综合了BBR和CGA的特征峰。FT-IR光谱显示CGA的羰基伸缩振动峰在形成BCS后强度减弱，提示羧基与季铵盐离子间可能存在静电相互作用。荧光光谱则观察到BCS的发射峰相较于单体出现了蓝移，这暗示了自组装过程中分子能级的变化。3) 核磁共振氢谱（1H NMR）分析：该分析提供了分子间相互作用的直接证据。谱图显示，BCS中BBR与CGA的质子信号积分比约为2:1。CGA芳香环上部分质子的化学位移发生变化，且羧基质子信号消失，这强烈支持了BBR的季铵氮与CGA的羧基/羟基之间通过静电作用结合，并且芳香环之间存在π-π堆积（π-π stacking）作用。4) 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）分析：ITC实验定量测定了BBR与CGA结合的热力学参数。结果显示这是一个自发的放热过程，结合常数（Ka）较高，化学计量比约为0.5（即CGA：BBR ≈ 1：2），与NMR结果相互印证。负的熵变（ΔS）表明自组装过程伴随着系统有序度的增加。综合以上数据，研究人员提出了BCS的自组装机制模型：首先，两个BBR分子与一个CGA分子通过静电相互作用（BBR的季铵离子与CGA的羧基/羟基）形成一个U型平面结构单元。随后，在π-π堆积和疏水作用的驱动下，这些U型单元进一步层层堆叠，最终组装成一个大型的两亲性球形超分子结构——内部为疏水的BBR片段，外部为亲水的CGA片段。这种独特的结构是提升其生物学活性的关键。
在完成了BCS的化学表征后，研究转向对其生物学性能的评估。首先评估了BCS的缓释性能和生物相容性。体外释放实验表明，与游离的BBR相比，BCS在24小时内呈现缓慢而持续的释放特性。溶血实验证明BCS在测试浓度范围内（10-100 μM）的溶血率极低，符合生物材料的安全标准。细胞毒性实验（CCK-8法）进一步证实，BCS及其对应的单体在10-80 μM浓度下，对RAW264.7巨噬细胞处理24或48小时均无明显毒性。此外，通过荧光显微镜观察FITC标记的BCS的细胞摄取情况，发现其摄取呈时间依赖性，12小时后细胞内荧光信号显著增强，表明其两亲性球形结构有利于细胞的高效摄取。
研究的核心生物学部分是评估BCS的抗炎效果并探究其作用机制。实验以脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞作为炎症模型。结果显示：1) 抑制炎症介质生成：BCS能显著且剂量依赖性地抑制LPS诱导的细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）爆发、一氧化氮（NO）的过量产生，以及炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18的分泌。重要的是，在同等浓度（10 μM）下，BCS的抑制效果显著优于BBR或CGA单体，体现了超分子组装带来的协同增强效应。2) 抑制细胞焦亡：通过碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放实验以及扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察，研究人员发现LPS刺激会导致巨噬细胞发生典型的焦亡形态学改变（细胞肿胀、膜孔形成、内容物释放）。而BCS预处理能显著减少PI阳性细胞比例、降低LDH释放，并在SEM下观察到细胞膜完整性得到更好的保持，表明BCS能够有效抑制LPS诱导的巨噬细胞焦亡。
为了深入阐明BCS抑制焦亡的分子机制，研究采用了多组学结合的方法。首先进行的是RNA测序（RNA-seq）分析。通过对对照组、LPS模型组和BCS处理组的巨噬细胞进行转录组测序和生物信息学分析，发现BCS处理回调的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）显著富集在NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）中。其中，非经典焦亡通路的关键蛋白caspase-11的基因表达在BCS处理后出现显著下调。这一发现为后续的机制研究提供了关键线索。基于RNA-seq结果，研究人员利用定量实时逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blotting）进行了验证。结果表明：1) 抑制NF-κB通路激活：BCS能显著抑制LPS诱导的核因子-κB（NF-κB）p65亚基的磷酸化，从而下调其下游促炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA表达。这解释了BCS抑制炎症介质释放的初步机制。2) 抑制非经典焦亡通路：BCS能特异性下调caspase-11的mRNA和蛋白表达水平。同时，它也抑制了经典焦亡通路相关分子（如NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18）的mRNA表达。由于caspase-11是感知细胞内LPS并启动非经典焦亡通路的核心传感器，其激活会切割Gasdermin D（GSDMD）形成膜孔，导致细胞焦亡。因此，BCS通过抑制caspase-11的表达，阻断了非经典焦亡通路的激活，进而减轻了由其引发的细胞焦亡和炎症因子释放。
本研究的结论明确而富有启发性。研究团队成功地从经典黄连-乌梅药对中获取灵感，利用超分子自组装策略，构建了由小檗碱和绿原酸以2:1摩尔比自组装形成的两亲性球形超分子BCS。其形成机制主要依赖于静电作用、π-π堆积和疏水作用。与单一游离药物相比，BCS因其独特的结构和缓释特性，能更有效地进入细胞，并在体外和细胞模型中展现出显著增强的抗炎活性。其抗炎机制是双重的：一方面通过抑制NF-κB p65的磷酸化来减少促炎介质的转录；另一方面，通过下调caspase-11的表达，抑制由caspase-4/5/11介导的非经典细胞焦亡通路，从而从源头上减轻过度的炎症反应和细胞损伤。这项研究最重要的价值在于，它首次从“超分子自组装”这一物理化学视角，为中医药的“配伍”理论提供了现代科学的阐释。它揭示了中药复方在煎煮过程中，不同活性成分之间可能通过自组装形成具有新结构和新功能的超分子实体，这可能是其产生“协同增效”或“减毒”作用的化学物质基础之一。这为理解和研究中草药复杂体系的作用原理开辟了一条崭新的路径。同时，BCS作为一种新型的、载体游离的超分子前药，也为开发高效低毒的抗炎药物提供了有潜力的先导化合物和新的设计策略。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，研究视角新颖，创造性地将超分子化学与中药配伍理论相结合，为诠释传统医学的科学内涵提供了前沿的交叉学科研究方法。第二，技术手段系统全面，从超分子的制备、精细结构表征（整合了TEM、NTA、NMR、ITC等多种技术），到系统的体外药效评价和深入的分子机制探索（涵盖RNA-seq、qPCR、Western Blot等多组学方法），形成了完整且严谨的证据链。第三，发现了明确的协同增效现象，即自组装形成的BCS其抗炎和抑制焦亡的效果显著优于其组成单体BBR和CGA的简单加和或单独使用，直观地体现了“1+1>2”的配伍效应。第四，机制研究深入，不仅关注了常见的NF-κB炎症通路，更将作用靶点延伸至相对前沿的非经典细胞焦亡通路（caspase-11），阐明了BCS发挥抗炎作用的更深层次机制。第五，研究结果具有潜在的应用转化价值，BCS作为自组装纳米粒，无需外源性载体，制备简便，生物相容性好，为基于天然产物的纳米药物研发提供了新范例。
此外，研究中关于BCS两亲性结构有利于细胞摄取的发现，以及其良好生物相容性的验证，都为这类超分子材料在生物医学领域的进一步应用（如靶向递送、联合治疗等）奠定了坚实的基础。这项研究是一项融合了传统智慧与现代科学、化学与生物学、基础研究与潜在应用的高质量交叉学科成果。