干酪乳杆菌发酵芡实上清液活性成分及抗氧化活性研究学术报告
一、 研究团队、发表期刊与时间
本研究由淮阴工学院生命科学与食品工程学院的闫雍雍、卞倩、焦心语和李松林*（通信作者）共同完成。研究成果以题为《干酪乳杆菌发酵芡实上清液的活性成分及抗氧化活性分析》发表于中文期刊《食品工业科技》（Science and Technology of Food Industry）2022年第43卷第24期，具体页码为145-152页，在线发表DOI号为10.13386/j.issn1002-0306.2022020173。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于食品科学、食品生物技术与功能性食品研究领域。研究的核心背景在于，芡实作为一种药食同源的植物资源，富含蛋白质、多酚、黄酮等多种生物活性成分，具有抗氧化等多种健康益处。然而，其天然结构限制了这些活性成分的生物可及性。近年来，利用微生物发酵技术，特别是乳酸菌发酵，来改善植物基质的营养价值和功能活性，已成为食品加工领域的研究热点。干酪乳杆菌作为一种广泛应用于乳制品和植物基质发酵的益生菌，其发酵过程能够产生酶系，分解大分子物质，释放小分子活性成分，并可能产生新的代谢产物，从而增强产品的功能特性。
尽管已有研究利用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等发酵芡实制备饮料或酒类，但利用干酪乳杆菌发酵芡实，并系统研究其发酵过程中上清液内活性成分的动态变化及其与抗氧化活性的相关性，在国内外尚未见报道。因此，本研究旨在填补这一空白。
本研究的具体目标包括：1）以芡实为原料，采用干酪乳杆菌进行发酵；2）系统监测发酵过程中上清液的pH、可滴定酸、多肽产率、多肽分子量分布、游离氨基酸组成、总酚、总黄酮含量的动态变化；3）评估发酵过程中上清液抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、亚铁离子螯合能力）的变化；4）分析上述各活性成分指标与抗氧化活性之间的相关性。最终，为开发高附加值的发酵芡实产品提供理论依据和数据支持。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个系统的发酵过程动态监测与分析实验，主要流程可分为样品制备、发酵过程、指标测定与数据分析三大部分。
1. 样品制备与发酵工艺： 研究首先建立了标准的发酵流程。选取籽粒饱满的去壳芡实100克，清洗后按5:1 (mL/g)的液固比加入去离子水，浸泡过夜后打浆，浆液经180目网筛过滤。滤液在121℃下灭菌15分钟，冷却后备用。实验所用的菌种为干酪乳杆菌Lactobacillus casei CICC 20995，经MRS培养基活化三代后使用。将活化后的菌种以9.0 lg CFU/mL的接种量接入灭菌后的芡实浆中，于38℃恒温条件下进行发酵。为了动态监测变化，研究在发酵开始后的0、12、24、36、48小时五个时间点进行取样。每次取样后，样品经10000 r/min离心10分钟，取上清液进行冷冻干燥，并于-20℃保存，用于后续各项指标的测定。
2. 各项指标的测定方法： 本研究采用了多种标准化学与仪器分析方法对发酵上清液的成分和活性进行表征。 * 基础指标：pH值和可滴定酸含量分别依据国家标准GB 5009.237-2016和GB 12456-2021进行测定，反映了发酵过程中酸度的变化。 * 多肽相关指标： * 多肽产率：采用三氯乙酸沉淀结合双缩脲法测定。将样品与三氯乙酸混合沉淀大分子蛋白，离心后取上清，与双缩脲试剂反应，在540 nm测定吸光度，对照Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线计算多肽浓度，并计算相对于发酵起始时的产率。 * 多肽分子量分布：采用高效液相色谱法进行分析。使用TSK-GEL G2000 SWXL凝胶柱，以乙腈:水:三氟乙酸（45:55:0.1, v/v）为流动相，在220 nm波长下检测，根据标准品（细胞色素C、杆菌肽、G-G-Y-R、G-G-G）的保留时间对多肽按分子量范围进行分段统计。 * 游离氨基酸含量：依据国家标准GB 5009.124-2016，采用氨基酸分析仪进行测定，提供了发酵过程中蛋白质降解为小分子氨基酸的详细数据。 * 酚类与黄酮类物质： * 总酚含量：采用福林酚法测定。用无水乙醇提取样品中的酚类物质，提取液与福林酚试剂和碳酸钠溶液反应后，于725 nm测吸光度，以没食子酸为标准品制作标准曲线进行计算。 * 总黄酮含量：采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定。提取液与亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠依次反应后，于510 nm测吸光度，以芦丁为标准品进行计算。 * 抗氧化活性评估：采用了三种体外抗氧化模型进行综合评价。 * DPPH自由基清除能力：将样品提取液与DPPH乙醇溶液混合，避光反应后于517 nm测定吸光度下降程度，计算清除率，并以人工抗氧化剂BHA作为阳性对照。 * 羟基自由基清除能力：基于Fenton反应体系，将样品提取液与硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸混合反应，于510 nm测定吸光度，计算对羟基自由基的清除率，同样以BHA为阳性对照。 * 亚铁离子螯合能力：样品提取液与氯化亚铁反应后，加入显色剂菲洛嗪，于562 nm测定吸光度，计算对亚铁离子的螯合率，以EDTA作为阳性对照。
3. 数据分析： 所有实验均进行三次重复，结果以平均值±标准差表示。使用OriginPro 2021软件进行数据的显著性差异分析（例如，不同时间点间的比较采用字母标记法，p<0.05视为差异显著）以及斯皮尔曼相关性分析，以探究各活性成分指标与三种抗氧化活性指标之间的关联程度。
四、 主要研究结果
本研究获得了关于干酪乳杆菌发酵芡实过程中活性成分转化与抗氧化活性提升的一系列明确结果。
1. 发酵过程中基础代谢与蛋白降解产物的变化： 发酵48小时后，上清液的pH从初始的6.30显著下降至3.97，而可滴定酸含量则从0.38 mL/g显著上升至2.53 mL/g。这明确证实了干酪乳杆菌在发酵过程中代谢产生了有机酸（主要是乳酸），这是发酵食品风味形成的基础。多肽产率在整个发酵期间持续上升，至48小时达到19.09%。更为重要的是，多肽的分子量分布发生了显著变化：分子量大于1000 Da的各类多肽比例均显著下降，而分子量在500-180 Da和小于180 Da的低分子量多肽比例显著增加，其中小于180 Da的多肽比例从49.99%增加至57.32%。这表明干酪乳杆菌分泌的蛋白酶有效地将芡实中的蛋白质水解成了更小的肽段。
2. 发酵过程中游离氨基酸、总酚及总黄酮的变化： 游离氨基酸总量在发酵48小时后增加了5.62倍。所有检测的必需氨基酸含量均显著增加，其中亮氨酸和苯丙氨酸的增加倍数尤为突出。在非必需氨基酸中，谷氨酸和精氨酸的增加量最大，而甘氨酸含量无显著变化。这一结果与多肽分子量分布的变化相呼应，共同证明了发酵导致了蛋白质的深度水解，最终生成大量游离氨基酸。同时，总酚和总黄酮含量也持续显著增加。发酵结束时，总酚含量从9.71 μg/g增加至18.00 μg/g，增幅达85.38%；总黄酮含量从4.30 μg/g增加至10.99 μg/g，增幅高达155.58%。这说明发酵过程不仅分解了蛋白质，也促进了结合态酚类和黄酮类物质的释放。
3. 发酵过程中抗氧化活性的变化： 三种抗氧化活性指标均随发酵时间显著提升。发酵48小时后，DPPH自由基清除率从10.73%提高至50.37%，羟基自由基清除率也显著提高至43.56%，而亚铁离子螯合率则提高了3.95倍。虽然与阳性对照BHA或EDTA相比仍有差距，但提升幅度非常显著。这些结果直接证明了干酪乳杆菌发酵能有效增强芡实上清液的体外抗氧化能力。
4. 活性成分与抗氧化活性的相关性分析： 斯皮尔曼相关性分析揭示了上述变化之间的内在联系。可滴定酸含量、多肽产率、总游离氨基酸含量、总黄酮和总酚含量这五个指标，与DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率及亚铁离子螯合率均呈现极显著的正相关关系（p<0.01），Spearman相关系数均大于0.94。这一强有力的统计结果意味着，发酵过程中酸度的增加、蛋白质水解（产生多肽和氨基酸）的进行以及酚类、黄酮类物质的释放，共同贡献了抗氧化活性的提升。低分子量多肽、特定的氨基酸（如脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸）以及酚类化合物中的官能团（如-OH, -COOH）被认为是发挥抗氧化作用的关键物质基础。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：干酪乳杆菌发酵能够有效促进芡实中抗氧化活性物质的释放和转化，显著提升其发酵上清液的体外抗氧化活性。发酵过程通过产酸、酶解蛋白质增加小分子多肽和游离氨基酸、释放多酚和黄酮等多重途径，协同增强了产品的抗氧化能力。
该研究的科学价值在于，首次系统阐明了干酪乳杆菌发酵芡实过程中多种活性成分的动态变化规律及其与抗氧化活性之间的定量相关性，为理解乳酸菌发酵改善植物基质功能活性的机理提供了具体案例和数据支撑。其应用价值在于，为开发以芡实为原料的、具有增强抗氧化功能的发酵饮料、调味品或膳食补充剂等产品提供了直接的理论依据和工艺参考。通过可控的发酵工艺，可以定向提升产品的营养功能和健康价值，这对于深度开发芡实这一传统药食资源、提升其经济附加值具有重要的实践意义。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究中引用和对比了多项前人工作，如利用其他乳酸菌发酵豆清液、燕麦乳、豆乳等的研究，以及关于多肽、氨基酸抗氧化机理的文献，这不仅为本研究提供了背景和对比，也展示了该领域的研究脉络。此外，文中对部分结果的可能机理进行了讨论，例如认为总酚增加可能是由于乳酸菌酶系统解离了多酚-蛋白质复合物，总黄酮大幅增加可能是复杂多酚被分解为简单黄酮类化合物等，这些讨论增加了文章的深度。