本研究由北京化工大学生命科学与技术学院的Jiajia Liu、Qiming Yan、Hongbo Qin、Ziyan Zhou、Xiaoyao Bai、Lei Wang、Yigang Tong和Xin Su等人完成，发表于2026年8月7日的《Science Advances》期刊。该研究开发了一种名为“cat-cube”（催化可转化DNA立方体）的新型DNA纳米结构探针，用于在活细胞内实时、原位可视化RNA病毒并评估抗病毒药物效果。

研究背景与目的

RNA病毒具有高突变率和快速复制的特点，是威胁全球公共卫生的重要病原体，包括埃博拉病毒、登革病毒以及导致COVID-19的严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）。SARS-CoV-2通过刺突蛋白（spike蛋白，S蛋白）与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合进入细胞并释放病毒基因组。传统的病毒检测方法如逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）虽在大规模筛查和临床诊断中发挥重要作用，但均为体外检测方法，无法实时揭示病毒与宿主细胞之间的动态相互作用。病毒标记方法（如荧光蛋白标记和量子点标记）虽可实现活细胞成像，但需要对病毒颗粒进行遗传或化学修饰，可能干扰病毒天然行为。同样，传统抗病毒药物筛选依赖于终点检测（如定量PCR、空斑试验或免疫荧光），需要裂解或固定细胞，无法动态、无损地监测感染和药物反应。因此，亟需一种无需标记、实时、能够在生理条件下工作的RNA病毒成像工具。DNA纳米技术因其结构可编程性、生物相容性和无酶信号放大能力，为细胞内生物传感提供了理想基础。然而，现有DNA探针多以分散分子形式工作，局部反应效率有限，且鲜有系统将灵敏检测与动态抗病毒评估整合到统一平台中。本研究旨在开发一种结构稳定、可自主进入细胞、能对病毒RNA进行高灵敏实时成像并用于抗病毒药物评价的DNA纳米结构。

研究流程与方法

研究首先进行cat-cube探针的构建与体外表征。cat-cube由DNA纳米框架（立方体）和四个催化发夹结构组成。合成分为两步：先将四条DNA链（CA至CD）缓慢退火形成DNA立方体骨架，再在37°C下将四个发夹DNA链（HA至HD）杂交到立方体骨架的特定边缘上，形成功能完整的cat-cube。所有DNA序列使用NUPACK软件设计。探针的检测机制基于催化发夹组装（catalytic hairpin assembly，CHA），其中病毒RNA作为催化剂触发级联链置换反应，使发夹构象改变，荧光团与淬灭团分离，产生荧光信号，同时RNA被释放以参与下一轮催化循环，实现不消耗靶标的信号放大。研究通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳验证了组装完整性，用原子力显微镜确认了颗粒形态。特异性测试以SARS-CoV-2 ORF1a区域的一段合成RNA为靶标，以其他单链RNA病毒序列为非靶标。动力学测试比较了cat-cube与两种（两个游离发夹）和四种游离发夹（四个游离发夹）体系的荧光动力学，所有发夹浓度保持一致。

其次，研究进行了单分子成像评估光物理性质。利用全内反射荧光显微镜（TIRF）对cat-cube和游离发夹进行30秒连续激光激发下的单分子荧光成像，统计荧光点数量随时间的变化以评估光稳定性，分析每个荧光点的光子输出，并计算信噪比。

第三，研究进行了活细胞内SARS-CoV-2病毒样颗粒RNA的成像。研究使用了一种生物安全等级2（BSL-2）级别的SARS-CoV-2转录和复制能力病毒样颗粒（trVLP）模型，该模型中N基因被绿色荧光蛋白报告基因替换，只有在表达N蛋白的细胞中才能完成完整生命周期。先验证Vero E6细胞对cat-cube的摄取动力学：将细胞与cat-cube（无淬灭团）孵育不同时间，监测荧光强度变化；用溶酶体共定位实验评估探针的胞内稳定性；用CCK-8实验评估细胞毒性。随后制备cat-cube传感细胞（预孵育100分钟），再用trVLP以不同感染复数（MOI）和不同时间感染，通过高倾斜层状光学（HILO）荧光显微镜和流式细胞术检测荧光信号变化。通过构建缺乏HB和HD组分的“不完全cat-cube”验证特异性，通过不同MOI（0至1）的剂量-反应实验评估灵敏度。

第四，研究利用cat-cube传感细胞实时评估抗病毒药物效果。测试了三种类型的抗病毒药物：ACE2抑制剂MLN-4760、靶向S蛋白的DNA适配体（两种）、以及天然化合物千金藤素（cepharanthine，CEP）。实验流程为：传感细胞与药物共培养后感染trVLP，或药物先与trVLP预孵育再感染传感细胞，通过荧光成像和流式细胞术定量细胞内荧光强度变化。

第五，研究对CEP的抗病毒机制进行深入解析。通过三种实验设计：（1）CEP与细胞预孵育不同时间（4至48小时）后再制备传感细胞并感染病毒，观察时间依赖性抑制效果；（2）CEP与病毒预孵育6小时后脱盐去除多余药物，再感染传感细胞，验证CEP与病毒颗粒的直接作用；（3）比较两种处理顺序（“先药后细胞”与“先药后病毒”）的差异，评估药物与ACE2受体早期结合的重要性。进一步通过分子对接和分子动力学模拟（50纳秒）分析CEP与ACE2及S蛋白受体结合域（RBD）的结合模式，用MM/PBSA方法计算结合自由能，用RMSD和RMSF分析结合稳定性。最后通过转录组测序分析CEP对宿主基因表达的影响。

主要结果

体外实验中，cat-cube对靶标RNA表现出良好的特异性，靶标RNA产生的荧光信号比空白对照组高3.8倍，而非靶标RNA几乎不产生信号。动力学分析显示，cat-cube的荧光信号产生速度和强度均显著优于游离发夹体系，终点荧光强度分别是两个游离发夹的1.6倍和四个游离发夹的3.4倍，表明立方体骨架的空间预组织提高了局部有效浓度，加速了链置换反应。

单分子成像显示，游离发夹的荧光点在30秒内减少了45%，而cat-cube仅减少约15%，表明cat-cube具有显著增强的光稳定性。在整个30秒照明期间，cat-cube的总光子数持续高于游离发夹，信噪比也更高，证明其成像质量更优。

活细胞实验中，cat-cube（无淬灭团）在100分钟后荧光信号达到平台期，且与溶酶体的共定位程度低，表明其能高效进入细胞且不易被溶酶体降解。游离发夹则大部分被排斥在细胞外，验证了cat-cube的自主细胞摄取能力。CCK-8实验显示细胞活性保持在90%以上，证明其无显著细胞毒性。病毒感染实验中，荧光信号随时间逐渐增强（MOI=1，0至6小时），流式细胞术证实了信号的渐进性增加。预孵育48小时后感染组信号仍比未感染组高2.4倍，表明cat-cube在细胞内功能可维持至少48小时。不完全cat-cube对病毒感染无响应，证实了探针的特异性。在MOI低至0.1时仍可检测到荧光信号，且信号强度随MOI增加呈剂量依赖性升高。

药物评估实验中，MLN-4760在1 μM浓度下使细胞内荧光强度降低68.3%。两种DNA适配体在100 nM浓度下分别使荧光强度降低69.2%和74.5%，而无义序列对照无降低效果。流式细胞术验证了适配体的剂量依赖性抑制作用。

CEP机制研究中，随着CEP与细胞预孵育时间从4小时延长至16小时，细胞内信号降至最低（34.2%），随后在48小时恢复至74.5%，呈现双相反应，提示药物存在抑制窗口期。CEP与病毒预孵育使荧光强度降低67.9%，表明CEP直接与病毒S蛋白结合。不同处理程序的比较显示，CEP与细胞先结合（程序I）的抑制效果（68.1%）优于后结合（程序II，48.4%），说明药物与ACE2受体的早期结合至关重要。分子模拟显示，CEP与ACE2的结合自由能为−33.34 kcal/mol，主要由范德华力驱动，结合界面局部灵活性降低。CEP与S蛋白RBD的结合自由能为−5.39 kcal/mol，同样主要依赖范德华相互作用。转录组分析显示CEP上调了多种核糖体蛋白基因，但未改变病毒进入途径蛋白的表达，提示其可能通过干扰病毒翻译效率发挥附加抗病毒作用。

结论与意义

本研究开发的cat-cube探针成功实现了活细胞内RNA病毒的实时、原位可视化，并可用于抗病毒药物效果的直接、动态评估。该平台具有自主细胞摄取能力、高灵敏度、高特异性和优异的光稳定性，能够在MOI低至0.1的条件下检测SARS-CoV-2病毒样颗粒RNA。功能化传感细胞可直接显示药物剂量依赖性和时间依赖性的抗病毒效果，无需核酸提取或细胞裂解。通过整合cat-cube成像、转录组分析和分子动力学模拟，研究阐明了CEP通过双重靶向ACE2受体和刺突蛋白抑制病毒进入的机制，并揭示了其时间依赖性的给药窗口。该研究为病毒学机制研究、抗病毒药物发现和生理相关条件下的治疗筛选提供了通用性平台。

研究亮点

本研究的创新性体现在三个方面。第一，探针设计上将催化发夹空间限制在刚性DNA立方体支架上，提高了局部反应浓度和检测灵敏度，同时RNA靶标在反应后被释放而非被消耗，避免了长期靶标捕获。第二，立方体结构赋予了反应产物优异的亮度和光稳定性，经单分子荧光分析验证，这是传统分散型DNA探针难以实现的。第三，该平台将分子检测与活细胞药效学读出直接耦合，首次实现了对单个活细胞内病毒RNA动态和药物响应的同步可视化，并通过多学科整合（成像、模拟、转录组学）揭示了天然化合物的双重靶点机制。