本文的主要作者包括 Weiping Xu, Shujuan Yi, Jie Liu, Yuyan Jiang, 和 Jiaguo Huang，文章发表于《Nature Communications》期刊 (2025 volume 16)，这是一本享有盛名的国际学术期刊。第一与通讯作者均来自中山大学药学院抗感染药物研发国家重点实验室以及新药设计与评价省重点实验室，加利福尼亚大学和斯坦福大学的部分联合作者也参与了该研究。文章的最终接受日期是2024年12月12日。
该研究属于生物正交化学（bioorthogonal chemistry）及分子荧光影像（fluorescence imaging）领域。生物正交化学近年来已成为活体动态分子成像与诊断的重要工具，其目的是通过“特定生物反应”触发特定分子行为，从而精准识别疾病相关生物标志物。然而，现有的激活型探针普遍存在信噪比（signal-to-background ratio，缩写SBR）低、检测灵敏度欠佳以及成像窗口时间短等问题，这直接限制了其对微小病灶（如早期肿瘤）的检测能力。
基于此背景，该团队提出了一种改进的成像机制，开发了一种新型硝基-氨基硫醇（NAT, Nitrile-Aminothiol）反应为基础的近红外荧光探针（近红外荧光，NIRF），用于实时超敏感地检测肝癌小病灶（肝细胞癌，HCC）。其目的是通过联锁的激活系统（dual-locked system）以及新设计的分子自组装策略，为精准早期癌症诊断提供创新性解决方案。
研究小组设计并合成了基于硝基半菁（nitrile-substituted hemicyanine）的激活型分子骨架，同时筛选出几种候选化合物（Cyn-1至Cyn-5）。这些化合物通过改变硝基位置、电子效应及桥链结构，考察其与氨基硫醇1,2位点的反应速度及荧光“开启”性质。 - 实验方法：化学合成实验结合荧光谱测定和二级反应速率常数分析。 - 筛选结果：Cyn-1显示出最佳反应速率（0.309 M^-1 s^-1）和最高荧光增强倍数（4.1倍），成为优化开发的核心骨架。
在下一步研发中，作者着重通过引入不同长度和柔韧性的分子链接链，优化探针分子自组装和环化反应效率。 - 实验设计：三种候选探针分子（Cyna4, Cyna7, Cynap）通过荧光显微技术、反应动力学（Reaction Kinetics）测试以及密度泛函理论（DFT）计算进行性能分析。 - 结果解读：Cynap（含柔性PEG链）显示最快的反应速率(7.97×10^-5 s^-1)和最高荧光开关效率(5.1倍增强)。通过电子密度分布分析，确定其光学跃迁能量显著优化。
为确保探针特异性，仅在肿瘤条件下被激活，研究团队引入谷胱甘肽 (GSH) 和肿瘤相关酶Cathepsin B（Cat B）作为双重触发信号，完成最终探针（Cynap-SS-FK）设计。 - 反应机制：Cynap-SS-FK分子包含一个GSH可响应的二硫键和一个可被Cat B裂解的多肽序列（Ac-FK）。这确保探针在健康组织中保持静默，而仅在肿瘤微环境中被特异性激活。 - 实验测试：通过细胞培养，证明探针在肝癌细胞（HCC-LM3）中的荧光信号逐渐增强，而经过GSH抑制剂（BSO）处理的细胞中信号显著弱化。这表明探针能够精准响应肿瘤微环境特征。
通过建立小鼠原位肝癌模型，研究团队进一步验证探针的体内成像效果。 - 模型设计：原位植入直径约为2 mm的肝癌小病灶，分别注射Cynap-SS-FK和一款“始终开启”对照探针（Cynap-T），动态追踪其成像表现。 - 实验结果： - Cynap-SS-FK实现约36小时的持续成像窗口，比对照探针显著延长。 - 主动增强的信噪比（SBR ~5）使肿瘤轮廓更清晰。 - 早期肝癌（2 mm直径）在5天即可被精准检测，而传统生化检测转氨酶（ALT/AST）需要延迟至15天才能显示差异。
该研究首次利用基于NAT点击反应的近红外荧光探针，实现超灵敏体内成像，对早期肿瘤诊断具有重要价值。相比传统荧光探针，这种设计大幅度提升了成像的信噪比和靶向性。此外，结合肿瘤特异性双锁定激活策略和“裂解-环化-自组装”机制，进一步延长了检测窗口期，为分子影像学的发展开辟了新的方向。
从科学角度看，该研究为生物正交化学迈向疾病诊断和成像这一实际应用提供了重要范例；从应用角度看，“Cynap-SS-FK”的成功可能推动生物影像技术在早期癌症筛查中的临床转化。
研究为多种疾病生物标志物的检测提供可扩展的“通用工具包”设计框架。未来可通过改变触发子单元，开发针对其他疾病（如代谢异常、感染性疾病）的特异性诊断工具。