单细胞核RNA测序揭示高脂饮食诱导肥胖下附睾白色脂肪组织的可塑性研究
一、 作者与发表信息 本研究由Anitta Kinga Sárvári, Elvira Laila van Hauwaert（共同第一作者）、Lasse Kruse Markussen、Ellen Gammelmark、Ann-Britt Marcher、Morten Frendø Ebbesen、Ronni Nielsen、Jonathan Richard Brewer、Jesper Grud Skat Madsen*（通讯作者）以及Susanne Mandrup*（通讯作者）共同完成。研究团队主要来自丹麦南丹麦大学功能基因组学与组织可塑性中心、生物化学与分子生物学系，以及丹麦分子生物医学成像中心。该研究成果于2021年2月2日发表于国际知名期刊《Cell Metabolism》（第33卷，437–453页）。
二、 学术背景与研究目的 科学领域： 本研究属于代谢生物学、脂肪组织生物学及单细胞组学交叉领域。 研究背景与动因： 白色脂肪组织是一种高度可塑的器官，其功能是储存和释放能量以应对机体的代谢需求。长期热量过剩导致的肥胖会引起脂肪组织发生显著变化，包括脂肪细胞肥大（体积增大）和增生（数量增加，源于前体脂肪细胞分化），以及免疫细胞浸润等组织成分的改变。这些变化是驱动2型糖尿病、心血管疾病等肥胖并发症发展的关键因素。因此，在单细胞水平上深入理解肥胖过程中脂肪组织内各类细胞的具体变化，对于阐明组织可塑性的细胞与分子机制至关重要。 然而，传统单细胞RNA测序技术难以捕获富含脂滴的成熟脂肪细胞，导致以往研究大多局限于脂肪组织中的基质血管部分（主要包括前体细胞、免疫细胞等），无法同时全面分析整个脂肪组织的所有细胞类型，特别是不同状态的成熟脂肪细胞。 研究目的： 本研究旨在利用单细胞核RNA测序技术，构建小鼠附睾白色脂肪组织（一种对肥胖反应极为显著的脂肪库）在单细胞核分辨率下的全面转录组图谱，并系统揭示其在因高脂饮食诱导肥胖过程中所经历的转录重编程和组织重塑，特别关注脂肪生成轨迹以及各类细胞（尤其是脂肪细胞）的异质性与可塑性。
三、 详细研究流程 本研究是一个系统性的组学与验证实验相结合的工作，主要流程如下： 1. 动物模型构建与样本准备： * 研究对象： 雄性C57BL/6JBomTac小鼠。 * 实验设计： 将小鼠分为两组，分别喂食低脂饮食（LFD）或高脂饮食（HFD）18周，以诱导肥胖模型。设立两个独立的生物重复队列（E1和E2）。此外，还构建了一个独立的验证数据集，包含分别喂食LFD和HFD 22周的小鼠各一只。 * 表型确认： 通过测量体重、进行腹腔葡萄糖耐量试验、称量附睾脂肪垫重量以及组织学分析（如苏木精-伊红染色测量脂肪细胞大小）来确认HFD成功诱导了肥胖、葡萄糖耐受不良和脂肪组织扩张。
2. 单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据生成： * 方法创新/特殊性： 本研究的关键技术突破在于采用了单细胞核RNA测序而非传统的单细胞测序。该方法通过分离组织细胞核进行测序，克服了成熟脂肪细胞因体积大、脂质含量高而难以被常规单细胞方法捕获的技术瓶颈，从而能够回收脂肪组织中所有主要细胞类型的转录组信息，包括成熟的脂肪细胞。 * 样本处理： 对于主要数据集，将每组（LFD或HFD）3只小鼠的附睾脂肪组织混合后进行细胞核分离。然后使用10x Genomics平台进行单细胞核RNA测序文库构建和测序。 * 质量控制： 对原始测序数据进行严格的质量过滤，去除低质量细胞核（如双联体、死细胞核等）和环境RNA影响较大的基因。
3. 数据分析与整合： * 数据整合： 使用Harmony等算法对来自不同饮食条件和生物重复的四个主要数据集进行整合，以减少批次效应，形成一个统一的细胞图谱。 * 细胞聚类与注释： 在整合后的数据上进行无监督聚类分析。通过差异表达基因分析、通路富集分析，并结合已知的细胞标志物，对每个细胞簇进行生物学注释。成功鉴定出脂肪细胞、纤维-脂肪生成祖细胞、免疫细胞（包括多种巨噬细胞亚群、树突状细胞、T细胞、B细胞）、内皮细胞（血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、内皮祖细胞）和间皮细胞（包括促炎性间皮细胞）等所有主要细胞类型，并能清晰区分并排除来自附睾组织的污染细胞核。
4. 细胞亚群深度解析与肥胖诱导变化分析： * 亚群再聚类： 对主要的细胞大类（如免疫细胞、FAPs、脂肪细胞等）进行独立的再聚类分析，以发现更精细的细胞亚群。 * 组成变化分析： 比较LFD和HFD条件下各细胞类型及亚群相对比例的变化。 * 差异表达分析： 识别在肥胖状态下，各细胞类型/亚群内发生显著上调和下调的基因。 * 轨迹推断分析： 利用RNA速率分析、PHATE降维和弹性主图等多种算法，基于FAPs和脂肪细胞的snRNA-seq数据，推断体内脂肪生成轨迹，从早期前体脂肪细胞到成熟脂肪细胞的分化过程。 * 细胞间通讯分析： 基于配体-受体共表达模式，推测脂肪组织内不同细胞类型之间的潜在信号交流。
5. 实验验证： * 免疫荧光显微镜验证： 为了在蛋白质水平验证snRNA-seq发现的脂肪细胞亚群，研究者从瘦鼠和胖鼠中分离出成熟脂肪细胞，对脂生成脂肪细胞标志物ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）和脂质清除脂肪细胞标志物神经瘤素（NNAT）进行共定位免疫荧光染色。 * 图像分析： 通过定量分析荧光信号强度，将脂肪细胞分为不同的亚群，并计算其相对比例和估计细胞体积，以验证snRNA-seq推断的亚群存在性、比例变化以及特定亚群（如应激性脂质清除脂肪细胞）与细胞肥大的关联。
四、 主要研究结果 1. 成功构建全面的附睾脂肪组织单细胞核转录组图谱： * 结果： snRNA-seq技术成功捕获了脂肪组织中所有已知的主要细胞类型（脂肪细胞、FAPs、免疫细胞、内皮细胞、间皮细胞）的细胞核。肥胖导致组织中免疫细胞（尤其是巨噬细胞）的相对比例显著增加，脂肪细胞比例相对下降。 * 逻辑联系与贡献： 此结果证明了所采用方法的有效性，为后续深入分析各类细胞在肥胖中的变化奠定了数据基础，并确认了肥胖相关的免疫细胞浸润现象。
2. 揭示肥胖导致巨噬细胞亚群发生重大转变： * 结果： 免疫细胞可细分为9个亚群，包括6个巨噬细胞亚群。基于标志物表达，这些巨噬细胞亚群被注释为：周血管样巨噬细胞、非周血管样巨噬细胞、脂质相关巨噬细胞、增殖性脂质相关巨噬细胞、胶原表达巨噬细胞和调节性巨噬细胞。 * 肥胖影响： 肥胖导致LAMs和增殖性LAMs的比例急剧上升，而PVMs和NPVMs比例下降。更重要的是，存留下来的PVMs和NPVMs在肥胖状态下也发生了显著的转录重编程：其巨噬细胞特征基因（如特定表面受体）和脂肪酸合成相关基因表达下调，而脂质处理相关基因（如PPARG， LPL）表达上调，呈现出向LAM样表型转变的趋势。此外，巨噬细胞中促炎细胞因子（如CCL8， SPP1， GRN）表达显著升高。 * 逻辑联系与贡献： 这些结果不仅量化了巨噬细胞亚群的组成变化，更重要的是揭示了肥胖诱导了一种普遍性的巨噬细胞功能转变——从维持组织稳态转向以脂质处理和炎症为特征的表型。这为理解肥胖相关脂肪组织炎症提供了更精细的细胞基础。
3. 发现间皮和内皮细胞在肥胖时呈现炎症状态： * 结果： 间皮和内皮细胞可分成5个亚群。肥胖导致促炎性间皮细胞比例增加，而经典间皮细胞比例下降。 * 肥胖影响： 这些细胞中大多数高表达的细胞因子基因在肥胖状态下被诱导上调，表明它们也参与了肥胖脂肪组织的整体炎症反应。 * 逻辑联系与贡献： 此结果扩展了对脂肪组织炎症来源的认识，提示除巨噬细胞外，其他基质细胞也是炎症因子的重要来源。
4. 明确脂肪生成祖细胞亚群及其对肥胖的反应： * 结果： FAPs可分为4个亚群（FAP1-FAP4）。通过与既往研究对比，FAP1与早期/干细胞样状态相关，FAP2为晚期前脂肪细胞，FAP3和FAP4更偏向成纤维细胞/炎症相关祖细胞。RNA速率分析表明FAP1可能向FAP2分化。 * 肥胖影响： 肥胖导致晚期前脂肪细胞（FAP2）比例增加，而成纤维细胞样亚群（FAP3/FAP4）比例下降。在FAP1和FAP2中，多个已知的脂肪生成抑制因子（如AR， SOX9， PDGFRA）表达下调。同时，所有FAP亚群中细胞因子和胶原相关基因表达上调。 * 逻辑联系与贡献： 这表明肥胖可能通过解除对脂肪生成的抑制，促进FAPs向前脂肪细胞状态（FAP2）定向，从而解释了肥胖时脂肪组织增生现象的部分机制。同时，FAPs也表现出促纤维化和促炎的表型转变。
5. 鉴定出三种功能不同的脂肪细胞亚群并揭示其肥胖诱导的可塑性： * 结果： 这是本研究的核心发现之一。脂肪细胞被划分为三个亚群： * 脂生成脂肪细胞： 高表达脂质合成、胰岛素响应相关基因（如ACACA， ELOVL6）。 * 脂质清除脂肪细胞： 高表达脂质摄取和转运相关基因（如ABCG1， APOE， CD36）。 * 应激性脂质清除脂肪细胞： 除具有LSA特征外，还高表达应激反应、缺氧和自噬相关基因（如GADD45G， HIF1A）。 * 肥胖影响： * 组成变化： 肥胖导致LGA亚群几乎消失，LSA和SLSA亚群比例显著增加。 * 免疫荧光验证： 通过ACLY和NNAT蛋白的共染色，在单细胞水平上成功观察到这三种脂肪细胞亚群的存在，并证实了肥胖后亚群比例发生与snRNA-seq一致的转变。进一步分析显示SLSA亚群的细胞体积更大，且肥胖后其体积进一步增大，提示SLSA代表应激的、肥大的脂肪细胞。 * 转录变化： 在肥胖的LSA和SLSA中，成熟脂肪细胞功能基因（如脂质合成、胰岛素信号通路基因）普遍下调，而免疫应答和细胞外基质重塑相关基因上调。 * 逻辑联系与贡献： 这一发现首次在单细胞水平上系统揭示了脂肪细胞的功能异质性。肥胖不仅改变了脂肪细胞的组成（从脂生成型转向脂质清除/应激型），还重塑了存续脂肪细胞的转录程序，使其功能受损并更具炎症性。这为解释肥胖状态下脂肪组织脂质合成能力下降、胰岛素抵抗和慢性低度炎症提供了新的细胞层面机制。
6. 描绘体内脂肪生成轨迹并发现分化“检查点”： * 结果： 通过整合FAPs和脂肪细胞数据，利用多种伪时间分析算法重构了从早期前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的体内分化轨迹。轨迹分析显示，晚期前脂肪细胞阶段（FAP2）似乎是一个“检查点”或“亚稳态状态”，细胞在此处积累，一旦通过某个阈值（可能涉及PPARγ活性），便会快速过渡为成熟脂肪细胞。 * 肥胖影响： 肥胖导致轨迹早期多个抗脂肪生成的转录因子（如MEIS1， RORA， ID3）表达下调。 * 逻辑联系与贡献： 此结果首次在体内描绘了完整的脂肪生成路径，揭示了分化过程的动态特征，并提示肥胖可能通过降低分化“刹车”来促进新生脂肪细胞的形成。
7. 推测细胞间相互作用： * 结果： 通过分析高表达的配体-受体对，预测了脂肪组织内潜在的细胞间通讯网络。例如，内皮细胞高表达的BMP6和PDGFD可能作用于前脂肪细胞上的受体，在血管周脂肪生成生态位中调节脂肪生成。 * 贡献： 为未来研究脂肪组织内细胞协作机制提供了线索和假设。
五、 结论与研究意义 结论： 本研究利用单细胞核RNA测序技术，首次成功绘制了小鼠附睾白色脂肪组织在瘦与肥胖状态下的全景式单细胞转录组图谱。研究发现，高脂饮食诱导的肥胖导致了脂肪组织深刻的细胞组成重构和广泛的转录重编程。关键结论包括：1) 脂肪细胞具有显著的异质性，可分为脂生成型、脂质清除型和应激型三个功能亚群，肥胖促使脂肪细胞从脂生成型向脂质清除/应激型转化，并伴随功能下降和炎症特征增强；2) 巨噬细胞发生向脂质处理表型的集体转变，且其他基质细胞（如FAPs， 内皮细胞， 间皮细胞）也普遍上调炎症程序；3) 肥胖可能通过解除对脂肪生成抑制因子的表达，促进前脂肪细胞分化；4) 体内脂肪生成轨迹存在一个关键的亚稳态前脂肪细胞检查点。 科学价值： 本研究为脂肪组织生物学领域提供了前所未有的高分辨率数据资源，极大地深化了对脂肪组织可塑性、细胞异质性以及肥胖病理生理机制的认知。它挑战了将脂肪细胞视为均质群体的传统观点，强调了从细胞状态转变的角度理解组织功能变化的重要性。 应用价值/重要观点： 该研究鉴定的特定细胞亚群（如SLSA脂肪细胞、LAM巨噬细胞）及其特征基因，可作为未来研究肥胖相关代谢疾病的潜在新型治疗靶点。研究揭示的脂肪生成调控机制和细胞间通讯网络，也为干预脂肪组织病理性重塑提供了新的思路。
六、 研究亮点 1. 技术突破： 首次将单细胞核RNA测序技术成功应用于完整白色脂肪组织，克服了技术瓶颈，实现了对包括成熟脂肪细胞在内的所有细胞类型的无偏性捕获和分析。 2. 核心发现： 系统鉴定了脂肪细胞的三种功能异质亚群，并阐明其在肥胖诱导下的可塑性转变，这是对脂肪细胞生物学认识的重要深化。 3. 全面解析： 不仅关注免疫细胞，还系统揭示了肥胖对脂肪组织中所有主要细胞类型（脂肪细胞、FAPs、内皮细胞、间皮细胞）的组成和转录状态的广泛影响，描绘了一幅全面的组织重塑图谱。 4. 体内轨迹： 首次基于体内数据，重构了从脂肪前体细胞到成熟脂肪细胞的完整脂肪生成发育轨迹，并发现了分化的关键检查点。 5. 严谨验证： 通过独立的动物队列、免疫荧光显微镜在蛋白质水平和细胞形态层面，对关键的snRNA-seq发现（脂肪细胞亚群）进行了交叉验证，增强了结论的可信度。 6. 资源价值： 产生了一个高质量、可公开获取的单细胞核转录组数据集，可作为未来脂肪组织研究领域进行假设驱动型研究的强大资源。
七、 其他有价值内容 本研究还展示了单细胞数据在跨物种比较和时间动态分析方面的潜在应用。研究者利用已发表的微阵列和RNA-seq数据，通过反卷积分析初步推断，小鼠脂肪细胞亚群的主要变化发生在高脂饮食8-20周之间，并与巨噬细胞区室的重塑时间点重合。此外，对肥胖人类内脏脂肪组织数据的类似分析也显示出与小鼠相似的趋势，暗示了研究发现的可能临床相关性。这些分析为后续研究肥胖发展的时间动力学和临床转化提供了初步线索。