本研究由Bertram Bengsch、Andy L. Johnson、Makoto Kurachi、Pamela M. Odorizzi、Kristen E. Pauken、John Attanasio、Erietta Stelekati、Laura M. McLane、Michael A. Paley、Greg M. Delgoffe以及通讯作者E. John Wherry共同完成。作者团队主要来自美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院微生物学系、免疫学研究所，以及匹兹堡大学癌症研究所肿瘤微环境中心免疫学系。该项研究成果于2016年8月16日发表于国际顶尖免疫学期刊《Immunity》（第45卷，第358-373页）。
此项研究聚焦于免疫学与代谢科学的交叉领域，旨在探究慢性病毒感染或癌症中CD8+ T细胞功能耗竭的早期驱动机制。T细胞耗竭（T cell exhaustion）是机体在应对持续存在的抗原（如慢性病毒或肿瘤）时发生的一种功能失调状态，其特征是效应功能（如产生细胞因子、杀伤靶细胞）逐渐丧失，并高表达多种抑制性受体（如PD-1）。尽管PD-1等免疫检查点抑制剂（immune checkpoint blockade, ICB）在临床治疗中取得了巨大成功，但T细胞耗竭如何起始、发展以及如何从根本上被逆转，其早期细胞生物学事件仍不甚清晰。之前的研究提示，T细胞代谢重编程是其激活、分化和行使功能的基础：效应T细胞（Teff）主要依赖糖酵解（glycolysis），而记忆T细胞（Tmem）则转向氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OxPhos）和脂肪酸氧化。然而，耗竭T细胞（Tex）的代谢状态及其调控机制，尤其是在耗竭进程的早期阶段，尚不清楚。因此，本研究的主要目标是：系统阐明在慢性感染初期，CD8+ T细胞是否发生以及如何发生代谢改变；探究这些代谢改变与耗竭程序启动之间的因果关系；并解析抑制性受体PD-1在其中扮演的关键调控角色。
为实现上述目标，研究团队设计并执行了一套逻辑严密、多技术平台整合的实验流程。研究对象主要为C57BL/6小鼠及其衍生的转基因品系。关键模型是使用两种不同的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic Choriomeningitis Virus, LCMV）株进行感染：Armstrong株（LCMV-Arm）会引起急性、自限性感染，用于生成功能正常的效应和记忆T细胞作为对照；而Clone 13株（LCMV-Cl13）则引起慢性持续性感染，导致病毒特异性CD8+ T细胞发生耗竭。研究大量使用了针对LCMV病毒gp33表位的T细胞受体（TCR）转基因P14 CD8+ T细胞，通过过继转移（adoptive transfer）到受体小鼠体内，实现对同一抗原特异性T细胞群体的精确追踪和操作。
研究的第一个核心步骤是转录组学分析与代谢通路富集。研究者对LCMV感染后不同时间点（第6、8、15、22、30天）从小鼠体内分选出的病毒特异性CD8+ T细胞进行了微阵列芯片分析（数据登录号GSE41867）。利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）这一生物信息学方法，他们比较了急性感染（Arm）与慢性感染（Cl13）早期（如第8天）和晚期（如第30天）T细胞的基因表达谱。结果发现，在感染早期，与Arm组效应T细胞相比，Cl13组的早期耗竭T细胞并未富集糖酵解通路基因，反而富集了氧化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸代谢和氨基酸代谢等多种代谢通路基因。这一发现十分反常，因为效应T细胞通常以糖酵解为主。这提示，早期耗竭T细胞可能存在代谢通路的转录上调，但实际功能可能失调。
为了验证转录组学的发现并直接评估细胞代谢功能，研究进入了第二个核心步骤：细胞能量代谢的实时功能检测。研究团队采用了海马（Seahorse）细胞能量代谢分析仪这一先进技术平台。他们在感染后第8天分选出CD8+ T细胞，进行线粒体压力测试（Mitochondrial Stress Test）和糖酵解压力测试（Glycolysis Stress Test）。具体而言，通过连续注射寡霉素（Oligomycin，抑制ATP合酶）、羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（FCCP，使线粒体解耦以测最大呼吸能力）、埃托莫西（Etomoxir，抑制CPT1a从而抑制脂肪酸氧化）和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，抑制糖酵解）等药物，实时监测细胞的耗氧率（Oxygen Consumption Rate, OCR）和细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR）。结果显示，与Arm组效应T细胞相比，Cl13组早期耗竭T细胞的基线OCR和ECAR均显著降低，其最大呼吸能力和备用呼吸能力也严重受损。当使用2-DG抑制糖酵解时，Cl13组细胞的呼吸被抑制了约50%，而Arm组抑制不明显，表明早期耗竭T细胞虽高度依赖葡萄糖供能，但其糖酵解能力实际上已受损。同时，使用葡萄糖类似物2-NBDG检测证实，早期耗竭T细胞的葡萄糖摄取能力确实低下。
基于上述功能缺陷，研究深入探索了第三个关键环节：线粒体质量与功能异常的机制。研究者使用线粒体荧光染料（MitoTracker Green用于指示质量，MitoTracker Deep Red用于指示膜电位）进行流式细胞术分析，并结合电子显微镜进行超微结构观察。令人惊讶地发现，尽管呼吸功能低下，早期耗竭T细胞的线粒体质量（体积/数量）反而高于正常效应T细胞。然而，其中存在大量膜电位去极化（depolarized）的线粒体，并且产生活性氧（ROS）水平升高。电镜显示这些线粒体形态异常，表现为融合、嵴延长和基质透亮。这表明，早期耗竭T细胞积累了大量体积庞大但功能失调的“垃圾”线粒体。
那么，是什么驱动了这种异常的线粒体生物合成与功能障碍呢？研究指向了第四个步骤：探究mTOR信号通路和PD-1抑制性受体的作用。检测发现，在Cl13感染早期，T细胞体内持续存在较高的mTOR信号活性（通过磷酸化核糖体蛋白S6，pS6来指示），这与持续的抗原刺激相符。然而，当用雷帕霉素（Rapamycin，mTOR抑制剂）短期处理小鼠时，虽然减少了T细胞总数，却显著降低了早期耗竭T细胞的线粒体质量和去极化比例。这提示，在慢性感染背景下，持续但可能失调的mTOR信号，在葡萄糖供应受限的情况下，驱动了异常的线粒体生物发生，最终导致线粒体功能崩溃。
最关键的一环是直接评估PD-1对早期代谢紊乱的因果性调控。研究者采用了精巧的共过继转移模型：将极少量的野生型（PD-1+/+）和PD-1基因敲除（PD-1-/-）的P14 T细胞混合后，过继转移到同一只小鼠体内，再用Cl13感染。这样可以在完全相同的体内微环境中直接比较两种细胞的命运。结果清晰地显示，在感染早期，与野生型细胞相比，PD-1缺陷的细胞葡萄糖摄取更高，线粒体质量更低，去极化线粒体比例更少，并且表现出更强的多功能性（能同时产生IFN-γ、TNF、IL-2等）。进一步的Seahorse分析证实，从PD-1敲除鼠中分离的CD8+ T细胞，其基础呼吸、糖酵解能力和糖酵解储备能力均显著高于野生型对照，几乎恢复到与急性感染效应T细胞相当的水平。这直接证明，PD-1在慢性感染早期就主动抑制了T细胞的糖酵解和线粒体呼吸功能。
接下来，研究探索了第五个步骤：下游分子机制与干预策略。通过基因表达分析，研究者发现PD-1信号抑制了一个关键的代谢主调控因子——过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达。PGC-1α是线粒体生物发生和氧化代谢的核心调控子。于是，他们通过逆转录病毒载体，在过继转移的P14 T细胞中过表达PGC-1α。结果显示，这一操作在体内成功逆转了早期耗竭T细胞的代谢表型：减少了线粒体质量和去极化，并显著提升了细胞的多功能性。这从功能上验证了PD-1→PGC-1α→线粒体代谢→T细胞功能这条调控轴的存在。
最后，研究还探讨了第六个方面：在已建立的慢性感染中及PD-1抗体治疗后的代谢状态。研究发现，即使到了感染后期（如第35天），耗竭T细胞的代谢抑制依然存在。有趣的是，耗竭T细胞内部也存在异质性：PD-1中等表达（PD-1int）的祖细胞样耗竭T细胞比PD-1高表达（PD-1hi）的终末耗竭T细胞具有更高的葡萄糖摄取能力和更活跃的代谢通路基因富集。当使用抗PD-L1抗体进行免疫检查点阻断治疗后，代谢重编程（葡萄糖摄取增加，线粒体质量减少）主要发生在PD-1int亚群中，这与该亚群是治疗响应的主要细胞类型相吻合。
本研究得出核心结论：代谢紊乱是CD8+ T细胞耗竭的早期驱动因素，而非仅仅是耗竭状态的结果。在慢性感染的第一周内，尽管存在持续的抗原刺激和mTOR信号，PD-1的激活却抑制了T细胞的葡萄糖摄取和利用，并下调了PGC-1α，导致糖酵解和线粒体氧化磷酸化功能同时受损。这种“能量供应不足”发生在细胞高生物合成需求（由持续mTOR信号驱动）的背景下，造成线粒体生物发生失调、膜电位去极化、ROS堆积等一系列代谢危机，进而推动了T细胞功能进行性丧失的耗竭程序。过表达PGC-1α或遗传性缺失PD-1可以改善代谢并增强功能，这证实了代谢调控与功能耗竭之间的因果关系。
本研究的科学价值重大。首先，它将T细胞耗竭的研究视角从晚期的表观遗传锁定和抑制性受体共表达，前移至早期的细胞代谢失调，为理解耗竭的起始机制提供了全新范式。其次，它详细阐明了PD-1如何通过调控PGC-1α等关键节点，从代谢层面“扼住”T细胞的能量命脉，深化了对免疫检查点生物学功能的认识。最后，研究揭示了耗竭T细胞内部（PD-1int vs. PD-1hi）存在代谢异质性，这解释了为何免疫检查点阻断治疗仅对部分耗竭T细胞有效。
在应用价值上，本研究为改进癌症和慢性感染的免疫治疗策略提供了关键启示。研究提示，直接靶向T细胞的代谢缺陷（例如，通过药物或基因手段增强其糖酵解或线粒体功能），或与现有的PD-1/PD-L1抗体联合使用，可能产生协同作用，更有效地“重启”耗竭T细胞，提高免疫治疗的效果和响应率。靶向代谢已成为肿瘤免疫治疗一个有前景的新方向。
本研究的亮点在于：1. 时效性突破：首次系统揭示了慢性感染初期T细胞发生的功能性代谢紊乱，将其确立为耗竭的早期驱动事件。2. 技术整合性：完美结合了体内感染模型、遗传学工具（基因敲除、过继转移）、高分辨率代谢功能检测（Seahorse）、流式细胞术、转录组学和电子显微镜等多层次技术，构成了完整而坚实的证据链。3. 机制深度：不仅描述了现象，还通过共转移模型和过表达实验明确了PD-1对代谢的因果性调控，并找到了PGC-1α这一关键下游节点。4. 临床相关性：研究结果直接联系到PD-1抗体治疗的响应细胞亚群和潜在联合治疗策略，具有明确的转化医学意义。此外，研究还发现了早期耗竭T细胞在葡萄糖受限时可能利用脂肪酸氧化的适应性生存策略，以及mTOR信号在异常线粒体生成中的复杂角色，这些都为后续研究开辟了新的思路。这项工作标志着对T细胞耗竭机制的理解进入了一个更根本的代谢调控时代。