单细胞测序揭示肾透明细胞癌多区域免疫格局与组织驻留T细胞同肿瘤拓扑及治疗疗效的关联

本研究由纪念斯隆凯特琳癌症中心的Chirag Krishna、A. Ari Hakimi、Timothy A. Chan、Christina S. Leslie等为主要作者，联合来自MSKCC多部门以及Illumina公司的多位研究人员共同完成。研究论文发表于*Cancer Cell*期刊，并于2021年5月10日正式出版。

学术背景 该研究的科学领域属于肿瘤免疫学与癌症基因组学，聚焦于肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma， ccRCC）。尽管ccRCC是一种高度免疫浸润的癌症类型，并且免疫检查点阻断疗法（Immune checkpoint blockade， ICB）的应用已改善了患者生存，但预测哪些患者对ICB治疗产生应答仍然是一个关键难题。既往研究表明，在其他实体瘤中预测ICB疗效的基因组标志物（如肿瘤突变负荷和PD-L1状态）在ccRCC中预测价值有限，这提示肿瘤免疫微环境可能在介导临床获益中扮演重要角色。虽然已有研究通过批量RNA测序或质谱流式细胞术对ccRCC进行了表征，但这些方法存在分辨率限制，并且通常基于单区域活检，无法充分捕捉患者内部免疫浸润的空间异质性。因此，为了更准确地预测患者反应并指导新疗法的开发，有必要以更高分辨率、更全面的方式解析ccRCC的免疫微环境及其在空间上的异质性。本研究旨在通过结合配对单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）和T细胞受体测序（T cell receptor sequencing， TCR-seq），同时进行多区域、多组织采样，以无偏见的方式深度剖析ccRCC的免疫微环境，并探索其与免疫疗法及靶向疗法疗效的关联。

详细工作流程 本研究是一项综合性研究，包含了样本收集、单细胞测序、数据分析和临床队列验证等多个步骤。 1. 患者队列设计与样本采集：研究纳入了6名晚期ccRCC患者，包括2名未接受过ICB治疗（ICB-naïve）的患者和4名接受过ICB治疗的患者（治疗方案包括抗PD-1单药或抗CTLA-4联合抗PD-1）。对于每位患者，研究者从手术切除的样本中采集了多区域、多组织样本。具体而言，从每个患者的肿瘤中采集了三个空间上分隔的区域：靠近正常肾组织的“近端”区域、远离的“远端”区域以及介于两者之间的“中心”区域。此外，还采集了淋巴结转移灶（如适用）、邻近的正常肾组织以及外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMCs）。总计分析了29个样本。 2. 单细胞测序与数据生成：对所有样本进行基于微滴的5’端单细胞RNA测序和TCR测序。在组织解离、活细胞分选后，使用10x Genomics平台进行文库构建和测序。最终，共获得了167，283个细胞的单细胞转录组图谱和43，828个细胞的TCR克隆型信息。所有样本同时进行了病理学审查，以评估组织学肿瘤消退情况、肿瘤形态学特征及免疫浸润情况，从而将分子发现与组织学特征相关联。 3. 单细胞数据整合、校正与细胞注释：对所有29个样本的转录组数据进行合并、标准化和批次效应校正，采用基于相互最近邻（mutual nearest neighbors， MNN）的方法以消除患者间的批次效应。通过主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）和均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection， UMAP）进行降维可视化，并使用Louvain算法进行聚类。通过层次性差异表达分析和已知标记物检查，成功注释出28个细胞簇，涵盖了T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、B细胞、髓系细胞（包括单核细胞、树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞）以及上皮细胞（包括癌细胞）等多个谱系。 4. 免疫异质性分析与TCR克隆型分析：计算每个样本中各免疫细胞簇的比例，以量化患者内部及患者间的免疫异质性。同时，对TCR测序数据进行分析，追踪肿瘤内扩增的T细胞克隆型在不同区域和不同组织（如肿瘤、正常肾、外周血）中的分布和表型。研究者还开发了一个名为“TCR轨迹分析（TCR trajectory analysis）”的分析框架，该方法整合了配对的αβ TCR序列信息和转录组数据，基于共享同一TCR克隆型的细胞来推断T细胞亚群之间的潜在分化轨迹。 5. 单细胞特征推导与验证：为了将单细胞发现应用于更广泛的临床队列，研究者开发了一套分层的特征基因推导方法。通过多轮差异表达分析，获得特定细胞亚群（如CD8A+组织驻留T细胞、TAM isghi亚群）的高特异性基因特征。这些特征通过独立队列的流式分选细胞批量RNA测序数据进行了特异性验证。 6. 临床队列验证与生存分析：将上述单细胞衍生的基因特征以及已有的临床相关基因特征（如Javelin signature、T effector signature、Angiogenesis signature等），通过单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis， ssGSEA）应用到多个大型、独立的ccRCC患者队列（包括TCGA、COMPARZ、IMmotion150、IMmotion151、JAVELIN 101和CheckMate 009）的批量RNA测序或微阵列数据中。通过分析这些特征与患者总生存期、无进展生存期或治疗反应之间的关联，来验证单细胞发现。

主要研究结果 1. 构建ccRCC单细胞免疫图谱，揭示细胞亚群多样性：研究成功构建了涵盖治疗前后ccRCC的多组织单细胞图谱。在CD8+ T细胞中，鉴定出5个亚群，包括耗竭型、增殖型、耗竭即刻早期基因型、组织驻留型（表达CD69、ZNF683等标记物）和NK样T细胞。CD4+ T细胞包括调节性T细胞、效应型、活化型、增殖型和幼稚型等。髓系区室中，特别详细刻画了4个肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage， TAM）亚群：TAM HLAhi（高表达HLA-DR，具有经典免疫抑制表型）、TAM HLAint（中等表达HLA-DR）、TAM ISGhi和TAM ISGint（低表达HLA-DR但高表达干扰素刺激基因，同时表达血管生成相关标记物如FLT1）。相关分析显示不同免疫亚群在肿瘤样本中呈现出协同富集的模式。 2. 揭示显著的瘤内及瘤间免疫异质性：通过多区域分析发现，即使在同一患者内部，不同肿瘤区域的免疫浸润也存在巨大差异。有些区域富含T细胞，而另一些区域则表现为T细胞排斥、TAM浸润的表型。病理学回顾证实，区域特异的免疫表型与肿瘤特征（如肿瘤消退程度、分级）相关。例如，在对ICB完全应答的患者中，所有肿瘤区域均显著富集CD8A+组织驻留T细胞，而TAM浸润较低；相反，在对ICB耐药的患者中，肿瘤区域主要呈T细胞排斥状态，并具有最高的TAM（特别是TAM HLAhi和HLAint）浸润比例。这一结果表明，CD8A+组织驻留T细胞可能与ICB应答相关，而特定TAM亚群可能介导了耐药性。 3. TCR克隆型分析提示组织驻留T细胞在ICB后的扩增：分析肿瘤内扩增的TCR克隆型发现，在大多数情况下，扩增的克隆主要来源于耗竭性T细胞池。然而，在对ICB完全应答和耐药的患者中，最扩增的克隆却来自CD8A+组织驻留T细胞亚群。这一发现，结合scRNA-seq和批量RNA-seq分析，提示ICB治疗后可能促进了组织驻留T细胞的活化与扩增，而非仅仅激活了传统的耗竭性T细胞。研究还发现，肿瘤内扩增的T细胞克隆在外周血和邻近正常肾组织中也能被检测到。 4. TCR轨迹分析揭示T细胞分化路径的差异：利用新颖的“TCR轨迹分析”框架，研究者探索了共享TCR克隆型的T细胞亚群间的潜在分化关系。分析表明，CD8A+组织驻留T细胞存在两条潜在轨迹：一条向耗竭状态分化，另一条向NK样T细胞状态分化。进一步分析发现，在对ICB完全应答和混合应答的患者中，组织驻留T细胞与NK样T细胞之间存在连续的轨迹，表明这些细胞状态可能发生互变；而在耐药患者中，组织驻留T细胞则处于更“固定”的状态，缺乏向其他状态分化的轨迹。这暗示T细胞亚群间的可塑性可能与治疗反应有关。此外，对扩增克隆的CDR3β序列相似性分析显示，在耐药和混合应答患者中，最扩增克隆周围存在一个序列高度相似的“邻居”区域，提示针对共同抗原的TCR序列趋同；而在完全应答者中未观察到类似现象，可能意味着其免疫反应更具特异性。 5. 单细胞特征在大型临床队列中验证其预测价值：研究者推导出的CD8A+组织驻留T细胞特征和TAM isghi特征在独立验证队列中显示出高度特异性。将这两个特征应用于大型临床试验队列（IMmotion151， JAVELIN 101）的基线批量RNA-seq数据时，发现：1）在接受阿特珠单抗（抗PD-L1）+贝伐珠单抗（抗VEGF）或阿维鲁单抗（抗PD-L1）+阿昔替尼（抗VEGF）联合治疗的ccRCC患者中，高水平的CD8A+组织驻留T细胞特征与显著改善的无进展生存期（PFS）相关。值得注意的是，在某些队列中，该特征的预测能力优于或等同于已有的T效应细胞或Javelin特征。2）在接受舒尼替尼（一种抗血管生成靶向药）治疗的患者中，高水平的TAM isghi特征与改善的PFS相关。这些发现将单细胞水平观察到的细胞亚群与临床疗效直接联系起来，为预测不同疗法的反应提供了新的生物标志物。

结论与意义 本研究通过多区域单细胞测序，系统性地解析了ccRCC的免疫微环境，揭示了其内部巨大的空间异质性，并明确了与ICB应答和耐药相关的关键免疫细胞亚群。研究首次在ccRCC中详细刻画了CD8A+组织驻留T细胞亚群，并证明其在ICB联合抗血管生成治疗后显著扩增，且其基线水平能预测联合疗法的临床获益。同时，研究鉴定出表达独特基因组合（干扰素刺激基因与促血管生成标记物）的TAM isghi亚群，并证明其与抗血管生成靶向治疗（舒尼替尼）的疗效正相关。开发的新型“TCR轨迹分析”方法为理解T细胞的分化与可塑性提供了新的视角。总体而言，该研究不仅为ccRCC的肿瘤免疫生物学提供了宝贵的资源性图谱，更重要的是，通过将高分辨率单细胞发现转化为可在临床实践中验证的基因特征，为开发更精准的免疫疗法和联合治疗方案、实现个体化治疗决策提供了重要的科学依据。

研究亮点 1. 技术方法综合性与创新性：首次在ccRCC中结合多区域、多组织（肿瘤、淋巴结、正常肾、外周血）的配对scRNA-seq和TCR-seq，全面解析了肿瘤免疫微环境的组成和空间异质性。 2. 发现新颖的关键细胞亚群：详细鉴定并功能关联了CD8A+组织驻留T细胞和一系列功能各异的TAM亚群（特别是TAM isghi），并阐明了它们在治疗反应中的不同角色。 3. 开发新型分析框架：提出的“TCR轨迹分析”框架，利用共享TCR克隆型信息推断细胞分化轨迹，为研究T细胞命运决定提供了新思路。 4. 从机制到临床的转化验证：研究并未止步于单细胞发现，而是通过严谨的特征推导和验证流程，在多个大型、独立的临床试验队列中证实了关键细胞亚群的预测价值，实现了从基础发现到临床生物标志物的成功转化，具有极强的临床应用潜力。 5. 揭示肿瘤免疫的空间复杂性：研究强调了基于单区域活检的批量分析可能因肿瘤内异质性而产生偏差，凸显了多区域采样在准确评估肿瘤免疫状态中的重要性。