本研究由来自德国海德堡大学肾病学系的 Stefan Hägele, Christian Nusshag, Alexander Müller, Alexandra Baumann, Martin Zeier 和 Ellen Krautkrämer*（通讯作者）团队完成。该研究成果于2021年发表在期刊 Virol J 上，论文标题为“Cells of the human respiratory tract support the replication of pathogenic old world orthohantavirus Puumala”。
一、 研究背景 本研究属于病毒学与传染病学交叉领域，聚焦于正汉坦病毒（Orthohantavirus）的致病机理。已知所有致病性正汉坦病毒均通过吸入受感染啮齿动物产生的含病毒气溶胶传播，感染后主要累及肺和肾脏。欧亚大陆的“旧世界”正汉坦病毒主要引起肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome， HFRS），而美洲的“新世界”正汉坦病毒则引起汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome， HCPS）。然而，临床上也观察到感染“旧世界”病毒（如普马拉病毒， Puumala virus， PUUV）的患者出现严重的肺部症状。这表明，呼吸道细胞可能不仅是病毒感染的初始靶点，也可能在欧亚正汉坦病毒感染的发病机制中扮演重要角色。先前的研究已确定整合素β3（integrin β3）是多种致病性正汉坦病毒进入细胞的关键受体，但其在人类呼吸道靶细胞中的表达和作用尚未详细阐明。因此，本研究旨在探究人类呼吸道原代细胞对“旧世界”正汉坦病毒PUUV的易感性，并分析相关受体在这些细胞中的表达情况，以阐明呼吸道在汉坦病毒感染初始阶段的作用。
二、 研究详细流程 本研究包含一套系统的体外细胞实验流程，主要分为以下几个步骤： 1. 细胞准备与表征：研究使用了四种来自人类呼吸道的原代细胞：人肺微血管内皮细胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells， HPMEC）、人支气管上皮细胞（Human Bronchial Epithelial Cells， HBEPC）、人小气道上皮细胞（Human Small Airway Epithelial Cells， HSAEPC）和人肺泡上皮细胞（Human Pulmonary Alveolar Epithelial Cells， HPAEPic）。为减少供体特异性差异的影响，每种细胞类型均测试了来自两名不同供体的细胞。所有细胞均使用商品化的专用培养基培养，并限于低传代次数（2-6代）使用。在感染实验前，通过免疫荧光染色检测了内皮细胞标志物CD31和上皮细胞标志物细胞角蛋白18（Cytokeratin 18， CK18）来确认细胞的类型特性。同时，通过免疫荧光初步检测了已知的正汉坦病毒受体整合素αvβ3的表达情况。 2. 病毒感染与检测：使用PUUV毒株（Vranica）以感染复数（Multiplicity of Infection， MOI）为1的剂量接种上述原代细胞。感染后，通过以下方法评估病毒感染情况： * 细胞内感染检测：在感染后第2、4、6天，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法（Western Blot）检测病毒核衣壳蛋白（N蛋白）的表达，以确定细胞是否被感染及感染比例。 * 病毒粒子释放检测：在感染后相同时间点收集细胞培养上清液。通过“第一轮感染测定法”来定量上清液中的感染性病毒颗粒：将上清液接种到易感的Vero E6细胞上，48小时后通过免疫荧光检测Vero E6细胞中的N蛋白，计算上清液中的感染单位（Infectious Units， IU），以此反映原代细胞释放具有感染性病毒颗粒的能力。 3. 受体表达分析：为更精确地了解病毒进入机制，研究进一步深入分析了相关受体的表达。 * 流式细胞术分析表面受体：检测了整合素αvβ3以及作为辅助受体的CD55在细胞表面的表达水平。 * 蛋白质印迹法分析受体亚基：检测了整合素β3亚基在细胞总裂解物中的表达，以补充表面表达的检测结果，并排除因α亚基限制而导致异源二聚体组装失败的可能性。 4. 数据统计分析：感染细胞百分比和病毒释放滴度等定量数据以三次重复实验的平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism软件，通过双尾Student‘s t检验比较不同供体细胞之间的差异，p值<0.05被认为具有统计学意义。
三、 主要研究结果 1. 呼吸道原代细胞支持PUUV的复制：免疫荧光和蛋白质印迹结果一致证实，所有测试的四种人类呼吸道原代细胞（HPMEC， HBEPC， HSAEPC， HPAEPic）均能被PUUV感染，并在细胞内检测到N蛋白表达。更重要的是，从这些感染细胞的上清液中也能检测到N蛋白，并且用这些上清液可以成功感染Vero E6细胞，这证明了这些细胞不仅被感染，还能产生并释放具有感染性的子代病毒颗粒，即支持病毒的“生产性感染”。 2. 支气管和细支气管上皮细胞的感染不依赖于整合素β3：一个关键发现是，尽管HBEPC和HSAEPC能够被PUUV有效感染并释放病毒，但流式细胞术和蛋白质印迹分析均未能在这两种细胞表面或内部检测到整合素αvβ3或整合素β3亚基的表达。与此相反，HPMEC和HPAEPic则明确表达整合素αvβ3和β3亚基。所有测试的细胞类型均表达辅助受体CD55。这一结果表明，PUUV感染支气管和细支气管上皮细胞可能通过不依赖于整合素β3的替代途径进入细胞。 3. 病毒复制动力学存在巨大的供体间差异：对感染进程的定量分析显示，不同供体来源的同类型细胞在感染效率和病毒释放动力学上存在显著差异。例如，在感染第6天，不同供体的HSAEPC感染细胞百分比相差可达3倍以上（#210供体为27.4%， #306供体为85.2%）；病毒释放量在不同供体间差异也很大，可达数个数量级。这种差异与整合素β3的表达状态无关（例如，表达该受体的HPAEPic和HPMEC也显示供体间差异）。复制动力学模式在不同细胞类型间也有所不同：在HPMEC、HSAEPC和HPAEPic中，感染细胞比例在感染后第2至第4天增长迅速；而在HBEPC中，病毒传播直到感染后第4天才开始明显增加。 4. 受体表达与感染易感性无直接关联：研究数据表明，细胞的易感性（初始感染率）高低并不直接取决于整合素β3的表达与否。例如，表达整合素β3的HPAEPIC #167细胞初始感染率较低（9.3%），而不表达该受体的HSAEPC #306细胞初始感染率却很高（47.1%）。这进一步支持了PUUV在呼吸道某些细胞中存在不依赖于整合素β3的、可能由其他受体或进入机制介导的感染途径。
四、 研究结论 本研究的核心结论是：人类呼吸道（包括支气管、细支气管和肺泡）的上皮细胞和肺微血管内皮细胞是“旧世界”正汉坦病毒PUUV的易感靶细胞，能够支持病毒的完整复制周期。这为PUUV通过吸入途径感染人体后，病毒在肺部初始复制和扩散提供了直接的实验证据。研究首次明确揭示，PUUV感染支气管和细支气管上皮细胞不依赖于已知的主要受体整合素β3，提示在这些细胞中存在一种替代性的病毒进入机制。此外，研究观察到不同个体来源的原代细胞在病毒感染和复制效率上存在显著差异，这可能部分解释了临床上汉坦病毒感染患者症状严重程度和表现存在广泛差异的原因。个体间在初始肺部感染阶段反应的差异可能影响疾病的后续发展进程。
五、 研究亮点与价值 1. 重要的科学发现：首次系统地证明了PUUV能在人类呼吸道整个通路的原代上皮细胞和内皮细胞中进行生产性复制，直接证实了呼吸道是病毒感染和潜在扩增的重要初始场所。 2. 机制新见解：挑战了整合素β3作为所有靶细胞唯一关键受体的传统认知，首次在人类原代细胞模型中提供了PUUV可通过非整合素β3依赖途径感染支气管/细支气管上皮细胞的强有力证据，为汉坦病毒细胞嗜性和进入机制的多样性研究开辟了新方向。 3. 研究模型优越性：使用了来自人类靶器官（肺）的多种原代细胞，并考虑了供体间差异，其结果比使用永生化细胞系更能反映人体内的实际情况，增加了研究的生理相关性和说服力。 4. 连接临床与基础：研究中观察到的巨大供体间差异，为理解汉坦病毒感染临床表现的异质性（从轻微症状到严重肺肾综合征）提供了潜在的细胞生物学解释，将基础研究与临床观察联系起来。 5. 应用价值：该研究强调了针对肺部早期感染的干预策略（如黏膜疫苗或吸入式抗病毒药物）在防治汉坦病毒病方面的潜在重要性。同时，寻找并鉴定在支气管上皮细胞中起作用的替代受体或进入因子，将成为未来开发广谱抗病毒药物的重要靶点。
六、 其他有价值的内容 文章在讨论部分还进行了深入的文献对比和意义延伸：指出新世界汉坦病毒（如安第斯病毒）也能感染呼吸道细胞，且致病性与非致病性病毒在肺上皮细胞系中的复制效率不同，支持了呼吸道作为共同初始靶点的观点。同时，作者也指出了本研究的局限性，即体外细胞培养模型无法完全模拟体内复杂的组织微环境和免疫细胞相互作用，但这些发现为在更复杂的模型（如类器官或人源化动物模型）中进一步研究汉坦病毒的发病机制奠定了坚实基础。此外，文章提到虽然病毒能在呼吸道细胞中复制，但除安第斯病毒外，汉坦病毒的人际传播极为罕见，其机制仍需探索，本研究为这一科学问题提供了新的研究线索。