主要作者及研究机构
本研究由Hyunji Park、Minjun Choi、Yu Zhang及Helen Oi-Lam Cheung等人共同完成第一作者工作，通讯作者为Mu He。研究团队主要来自香港大学李嘉诚医学院生物医学学院，合作单位包括加拿大多伦多大学病童医院发育与干细胞生物学项目、香港科技大学、德国马普生物化学研究所以及台湾阳明交通大学等。该研究成果于2025年12月16日发表于《PNAS》（Proceedings of the National Academy of Sciences）第122卷第51期。
学术背景
运动纤毛（motile cilia）是真核生物中具有化学与机械感知功能的重要细胞器，广泛分布于哺乳动物的呼吸系统、神经系统和生殖系统。它们通过产生协调的波动来驱动液体流动，在脑室脑脊液循环、呼吸道黏液清除以及生殖道配子运输中发挥不可替代的作用。运动纤毛功能障碍可导致原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD），患者常表现为慢性呼吸道感染、中耳炎、内脏转位及不育等临床症状。然而，尽管科学家们已经鉴定了大量纤毛结构组分并解析了其原子水平的结构，运动纤毛在脊椎动物体内的组装机制仍不明确。
运动纤毛与初级纤毛（primary cilia）在结构上存在关键区别：运动纤毛具有“9+2”微管轴丝结构，包括9对外周双联微管和2根中央单微管，还具备动力蛋白臂、放射辐（radial spokes）及微管内蛋白（microtubule inner proteins，MIPs）等运动相关结构。两者均由基体（basal body）模板化组装，并经纤毛内运输（intraflagellar transport，IFT）系统运输构建组分。过渡区（transition zone，TZ）位于纤毛基部的质膜与轴丝交界处，由CEP290、NPHP复合物和MKS复合物等保守蛋白构成，在初级纤毛中已被证实发挥扩散屏障（diffusion barrier）功能，选择性调控纤毛内蛋白的进出。但在运动纤毛中，TZ是否以及如何调控运动特异性蛋白的掺入，之前并不清楚。
本研究的目标是鉴定调控哺乳动物运动纤毛组装的关键分子，并阐明其作用机制。研究者通过系统的生物信息学筛选策略，最终聚焦于KIF27——一种属于kinesin-4家族的马达蛋白，也是Hedgehog信号通路调控因子COS2/KIF7的同源蛋白。
研究流程与实验方法
本研究采用了多层次的实验策略，从基因筛选、动物模型构建、超微结构分析到体外生化实验，系统地揭示了KIF27在运动纤毛组装中的功能与机制。具体流程如下：
第一步，候选基因的计算机筛选。 研究者利用小鼠和人气道、小鼠室管膜以及人输卵管多纤毛细胞的单细胞RNA测序公共数据集，筛选出在多纤毛细胞中差异表达的基因。随后剔除已收录于纤毛病和PCD基因面板中的条目，以及初级纤毛和运动纤毛蛋白质组中共有的蛋白编码基因，最终得到约80个候选基因。通过文本挖掘筛选出具有运动纤毛表型报道的基因，并进一步要求其直系同源基因存在于从锥虫、海葵到小鼠和人类等多种具纤毛物种中。KIF27满足所有筛选标准，且已有研究表明其在涡虫纤毛发生、小鼠早期致死以及运动纤毛基部定位中具有潜在功能。
第二步，KIF27基因敲除小鼠模型构建及表型分析。 研究者通过删除小鼠Kif27基因的第一个蛋白编码外显子，构建了Kif27−/−基因敲除小鼠。所有纯合突变小鼠均出现圆顶状头部、鼻腔黏液阻塞，平均寿命约两周，雄性表现出精子发生缺陷。扫描电子显微镜和免疫染色显示，突变小鼠脑室管膜和呼吸道上皮的运动纤毛形态异常、长度缩短。透射电子显微镜分析发现，正常“9+2”构型在Kif27−/−呼吸纤毛中仅存于不足20%的纤毛中，接近40%的纤毛完全缺失中央微管（9+0），约30%的纤毛外周双联微管数目不足9对。扩张显微镜分析进一步证实了中央微管缺失、外周双联微管减少及排列紊乱等结构缺陷。
第三步，KIF27亚细胞定位与蛋白互作分析。 为确定KIF27在运动纤毛发生过程中的时空定位，研究者构建了Kif27-GFP报告基因小鼠。在胚胎呼吸道上皮细胞中，KIF27-GFP首先出现在deuterosome阶段，与中心粒远端蛋白CP110共定位；当中心粒对接至顶端质膜时，与纤毛过渡纤维标记物CEP164共定位；纤毛形成起始后，KIF27-GFP富集于新生短纤毛的轴丝远端，在成熟长纤毛中丰度降低。免疫共沉淀实验证实KIF27与TZ蛋白CEP162直接结合，结构域定位分析表明二者的结合界面分别为KIF27的C端卷曲螺旋区（KIF27-CC2）和CEP162的N端柔性区。进一步实验显示CEP162可作为桥梁蛋白将KIF27与CEP290连接形成三元复合物。
第四步，TZ组织结构分析。 利用晶格结构照明显微镜（lattice SIM）超分辨成像技术，研究者对运动纤毛TZ中各标志蛋白的轴向排列进行了精确定位。在Kif27−/−纤毛中，CEP290、RPGRIP1L和MKS1的信号强度显著降低。扩张显微镜分析揭示突变纤毛中CEP290和RPGRIP1L的分布域向远端扩展且不对称，TZ环状结构中点状信号之间的间隙增多，CEP290环中低于九重对称的比例显著增加。
第五步，运动纤毛蛋白质组学分析。 研究者从小鼠气管上皮细胞（MTECs）中分离纤毛组分进行质谱分析。结果显示，Kif27−/−纤毛中几乎所有中央微管相关蛋白均严重缺失，外周二联微管腔内蛋白如CFAP20、tektin和PIERCE复合物也显著减少，而动力蛋白臂和放射辐蛋白丰度受影响较小。相反，IFT复合物和BBSome核心组分在突变纤毛中轻度上调。
第六步，原位冷冻电子断层扫描。 利用原位冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）结合聚焦离子束减薄技术，研究者在近天然状态下观察了纤毛轴丝的超微结构。亚断层平均图显示突变纤毛外周二联微管中tektin复合物和NME7的密度显著降低。此外，突变纤毛管腔中出现大量异常电子密度，提示非正常蛋白滞留。
第七步，KIF27马达活性的体外与体内功能分析。 全内反射荧光显微镜单分子运动分析显示KIF27马达二聚体沿微管呈ATP依赖性运动，但其速度仅为25.5 nm/s，远慢于典型kinesin-4家族成员。研究者构建了携带R206K点突变的Kif27小鼠——该突变完全阻断KIF27的ATP依赖性运动能力。Kif27R206K/R206K纯合小鼠全部存活，无脑积水或鼻黏液积聚，其纤毛搏动频率与野生型无显著差异，TZ组织结构基本恢复。这些结果表明KIF27的马达运动能力对其运动纤毛组装功能并非必需。
主要结论与价值
本研究首次揭示了KIF27在哺乳动物运动纤毛组装中的核心调控作用。KIF27通过与CEP162和CEP290形成蛋白复合物，在TZ处建立细胞骨架支架，调控TZ的结构完整性和屏障功能，从而促进运动特异性结构蛋白的正确掺入。Kif27缺失导致TZ组织异常、轴丝结构缺陷和纤毛搏动障碍，最终产生类似PCD的疾病表型。研究还发现KIF27在脑室管膜纤毛和呼吸纤毛中具有关键功能，但在输卵管纤毛中则表现出组织特异性冗余。
该工作的科学价值在于建立了TZ屏障功能与运动纤毛组装之间的直接因果联系，提出了运动纤毛组装的一般性构建原则。从进化的角度看，KIF27/KIF7/COS2 kinesin家族的祖先功能可能是形成微管相关支架以介导蛋白质互作，本研究为此假说提供了有力证据。在应用层面，这一发现提示TZ基因的病理变异可能同时影响初级纤毛和运动纤毛，运动纤毛相关临床表现可能在纤毛病患者中被低估。该研究为扩展运动纤毛病基因列表和开发恢复纤毛运动功能的新型治疗策略提供了理论依据。
研究亮点
本研究的方法学亮点在于整合了多种技术手段，包括单细胞转录组筛选、CRISPR基因编辑小鼠模型、超分辨扩张显微镜、原位冷冻电子断层扫描、纤毛蛋白质组学以及体外单分子运动分析，实现了从基因到分子机制的多层次解析。特别值得关注的是KIF27“马达活性非必需、支架功能关键”这一发现，颠覆了传统对kinesin蛋白功能的理解模式，为阐明纤毛病发病机制和后续药物靶点开发提供了新的视角。