类型A：原创研究学术报告
一、研究基本信息
本研究由来自挪威和丹麦多家机构的研究人员共同完成。主要作者包括Hege Marie Vedeld、Heidi Pharo（共同第一作者）、Anne Klara Sørbø、Sara Brandt-Winge、May-Britt Five、Marine Jeanmougin、Per Guldberg、Rolf Wahlqvist，以及通讯作者Guro Elisabeth Lind。研究单位包括挪威奥斯陆大学医院挪威镭医院癌症研究所分子肿瘤学系、奥斯陆大学医院泌尿外科系、丹麦癌症协会研究中心、南丹麦大学癌症与炎症研究所以及奥斯陆大学生物科学系。这项重要的纵向研究成果于2024年5月8日在线发表于国际知名学术期刊《Molecular Oncology》上。
二、研究背景
膀胱癌是全球第十大常见恶性肿瘤，2020年新发病例约57万，死亡人数超20万。约75%的患者初诊为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC），其5年癌症特异性生存率接近90%，但面临着高复发率和高进展率的挑战。在高风险患者中，5年内复发概率可达78%，进展为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）的概率达45%，一旦进展，生存率将骤降至35%。因此，NMIBC患者需要接受长期频繁的监测。
目前，膀胱镜检查（cystoscopy）是NMIBC监测的金标准，但该方法具有侵入性、费用昂贵、给患者带来不适等缺点，且其准确性并非最佳，尤其是容易漏诊原位癌（carcinoma in situ, CIS）。尽管已有多种尿液生物标志物检测方法获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准，但由于各项研究准确性不一、对低级别肿瘤敏感性差以及临床获益不明确等问题，尚未有分子标志物检测在临床实践中被常规使用。此外，绝大多数研究采用单次访视设计，无法捕捉个体患者的纵向临床过程。
基于此，本研究旨在通过一项纵向、前瞻性、观察性队列研究，探索通过分析尿液样本中的尿液肿瘤DNA（urine tumor DNA, utDNA）来替代膀胱镜进行膀胱癌复发监测的潜力。研究特别关注utDNA分析在检测肿瘤复发、减少膀胱镜检查次数以及指导个体化监测方案方面的应用价值。
三、研究流程
本研究采用了一套严谨的纵向监测流程，主要包括以下几个步骤：
1. 患者入组与基线评估：研究于2017年1月至2018年9月在挪威奥斯陆大学医院纳入疑似膀胱癌并拟行经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of the bladder, TURB）的患者。根据严格的纳入和排除标准，共有59名患者符合入组条件。每位患者在TURB前提供两份独立的初始尿液样本（通常一份在家晨起收集，一份在医院收集），以增加检测灵敏度。随后，患者接受TURB并进行组织学评估，以明确诊断和分期分级。肿瘤分期依据2017年TNM系统，分级依据WHO 2004/2016分类系统。
2. 合格筛选与监测队列建立：研究的关键一步是利用名为“BladMetrix”的DNA甲基化生物标志物测试，对初始尿液样本进行utDNA分析。只有术前utDNA检测呈阳性的患者，才具备接受后续utDNA监测的资格。最终，在59名符合入组条件的患者中，有47名（80%）检测出utDNA阳性，由此进入了为期2年的监测队列。
3. 纵向尿液采样与膀胱镜监测：合格的47名患者按照挪威国家指南的建议，定期接受膀胱镜监测检查。在研究设计的2年随访期内，每次进行膀胱镜检查前，患者均需提供两份平行的尿液样本用于utDNA分析。平均每位患者提供了7次（范围2-9次）监测点的样本，最终共纳入261个监测点进行分析。
4. 尿液样本处理与DNA甲基化分析：尿液样本在收集后迅速送至实验室进行处理，大部分在采样后3小时内完成。样本经离心、PBS洗涤等步骤后，从尿液中沉淀的细胞团块（pellet）中提取DNA。选择尿液沉淀而非上清的主要原因是为了获得更高的DNA产量和更便捷的处理流程。提取的DNA经重亚硫酸盐转化（bisulfite conversion）后，采用微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）技术，利用BladMetrix测试对8个选定的DNA甲基化生物标志物进行定量分析。BladMetrix是基于ddPCR平台开发的专用检测方法。分析过程中使用通用甲基化人DNA标准品作为阳性对照，健康人血或非甲基化DNA作为阴性对照。阳性微滴的判读利用R语言中的“podcall”Shiny界面完成。其中，一个名为“4plex”的内部对照用于数据归一化处理。每个生物标志物都有预设的甲基化浓度阈值，以判定其阳性或阴性。最终的utDNA分析结果判定标准是：若8个标志物中有2个或以上被判定为甲基化，则该次utDNA检测结果定义为阳性。
5. 数据分析与参考标准：utDNA检测结果与标准参考（即膀胱镜和组织学检查结果）进行比较。准确性的评估标准如下：阳性utDNA结果得到组织学或膀胱镜确认即为真阳性；阴性utDNA但膀胱镜为阳性且经组织学确认则为假阴性；阴性utDNA且膀胱镜检查为阴性或阳性但组织学为阴性则为真阴性；阳性utDNA但膀胱镜检查阴性且后续无复发确认为假阳性。研究还特别定义了“早期检测”：即在后续被确认复发的患者中，当前的utDNA结果为阳性，但膀胱镜检查为阴性，或膀胱镜检查为阳性但组织学为阴性。通过计算灵敏度、假阴性率等指标来评估utDNA检测的性能。
四、主要研究结果
在整个研究期间，47名患者中共观察到23次肿瘤复发，其中17次由组织学确认，6次仅由膀胱镜确认。
1. 检测灵敏度与准确性：utDNA分析成功检测出23次复发中的21次，总体灵敏度高达91%。具体来看，对于T1、T2期肿瘤和原位癌（CIS），检测灵敏度达到了完美的100%（5/5），对于Ta期肿瘤的灵敏度为83%（10/12）。按照肿瘤分级分析，utDNA对高级别（high-grade）复发的检出率为88%（7/8），对低级别（low-grade）复发的检出率为89%（8/9）。若根据患者入组时的肿瘤级别进行分层，基线为高级别肿瘤的患者，其复发检测灵敏度为100%（10/10）；基线为低级别肿瘤的患者，灵敏度也达到了85%（11/13）。仅有0.8%（2/261）的utDNA检测结果为假阴性，显示出极低的漏检率。
2. 减少膀胱镜检查的潜力：研究期间，共有143次监测点的utDNA结果为真阴性。这意味着，如果使用utDNA进行预筛，理论上可以在这143个监测点免于膀胱镜检查，从而使膀胱镜检查的总次数减少55%（143/261）。从患者层面看，这将使79%（37/47）的患者至少免去一次不必要的膀胱镜检查，极大地减轻了患者的痛苦和医疗系统的负担。
3. utDNA的纵向动态模式与早期检测能力：研究的纵向设计揭示了utDNA的几种独特动态模式，这是本研究最引人注目的发现之一。 首先，在23次复发中，有11次（48%）通过utDNA被提前发现，涉及8名患者（17%）。utDNA阳性结果比临床确诊复发提前出现的中位时间为6.5个月（范围3-18个月），涵盖24个监测点。在这些早期检测案例中，20次是utDNA阳性而同期膀胱镜阴性，随后才经TURB或膀胱镜确认复发。
其次，在3名患者中观察到了提示微小残留病灶（minimal residual disease, MRD）的模式。其特征是从初始TURB术后到复发前，每次监测点的utDNA检测均为阳性，而在复发性肿瘤被手术切除后，utDNA信号消失。这表明在初次手术后，体内可能残留了常规手段无法检测到的癌细胞克隆，这些细胞持续向尿液释放肿瘤DNA。
最后，在7名患者中观察到了提示“区域效应”（field effect）或“区域癌化”（field cancerization）的模式。其中3名有早期检测信号的患者，即使在复发性肿瘤被切除后，utDNA检测仍持续呈阳性。另有4名在整个研究期间未出现临床复发，但utDNA检测却一直接呈阳性。这表明，患者看似正常的膀胱黏膜可能已经获得了分子层面的癌前改变（如DNA甲基化异常），这些异常细胞同样会脱落释放utDNA，预示了未来发生恶性转化的高风险。
五、研究结论与价值
本项纵向研究表明，基于BladMetrix测试的utDNA分析在监测膀胱癌复发方面具有极高的灵敏度（91%），能够准确检出所有分期和分级的肿瘤，尤其对高危的T1、T2及CIS病变实现了100%的检出。该技术展现了将膀胱镜检查次数减少55%的巨大潜力，惠及近80%的患者，这对于改善患者生活质量和降低医疗成本具有重要的应用价值。
更为重要的是，utDNA分析打破了常规诊断的局限，能够揭示隐藏在标准临床检查之下的生物学现象。它不仅能比膀胱镜更早地预警肿瘤复发，还能通过提示微小残留病灶（MRD）和区域效应，为临床医生提供更深层次的肿瘤生物学信息。这些信息对于指导制定个体化的治疗决策（如更积极地启动BCG治疗）和监测方案（如采用更频繁或使用光动力学诊断等更灵敏的膀胱镜检查）具有不可估量的指导意义。
六、研究亮点
七、其他有价值的内容
研究还意识到其局限性和未来方向。例如，使用膀胱镜而非病理作为部分病例的参考标准可能引入偏倚；分析的样本量相对有限；收集两份平行尿液样本增加了成本，未来需进行成本效益分析。尽管如此，鉴于其纵向研究的深度和丰富发现，该研究为utDNA在膀胱癌监测中的临床应用奠定了坚实基础，并为理解膀胱癌复发和进展的分子机制提供了宝贵见解。研究团队之前已在大型血尿患者群体验证过BladMetrix测试的高准确性，这进一步增强了本研究结果的可信度。