基于脑类器官与多组学平台研究卒中损伤机制及药物反应

主要作者及单位： 本研究由Ling Leng（中国医学科学院北京协和医院）、Jie Ma（北京生命组学研究所）和Junying Wei（中国中医科学院中药研究所）作为共同通讯作者领导，第一作者为Wendi Zhu、Yue Wu和Xiao Li。研究于2024年10月11日在线发表于《Bioactive Materials》期刊。

学术背景： 脑卒中（stroke）是全球致死和致残的首要原因之一，其中缺血性卒中（ischemic stroke）占绝大多数。尽管在动物模型研究中，许多药物已显示出对卒中的保护效果，但在临床实践中却鲜有显著疗效，这一转化鸿沟可能源于人类与啮齿类动物在大脑结构和生理功能上的巨大差异。此外，缺氧（hypoxia）是缺血性卒中病理过程中的核心环节之一，会导致兴奋性毒性、氧化应激、线粒体损伤等一系列级联反应。因此，建立能够模拟人脑缺氧损伤的生理模型，成为研究缺血性卒中治疗药物的瓶颈问题。由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的脑类器官（brain organoids）能够重现人脑的细胞结构和特定细胞间信号连接，为在体外模拟神经系统疾病提供了前所未有的机会。本研究的核心目标是利用脑类器官结合多组学策略，建立一个研究卒中损伤机制和药物筛选的新平台，并探索传统中药复方灯盏生脉胶囊（Dengzhanshengmai capsule, DZSM）的治疗潜力。

研究流程与主要结果：

研究首先通过构建经典的脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型来模拟体内缺血性卒中，并在术后72小时对脑组织进行病理学和定量蛋白质组学分析。苏木精-伊红（H&E）染色及免疫荧光结果显示，卒中模型小鼠脑组织出现神经元损伤、血管水肿和神经纤维紊乱，同时星形胶质细胞标志物（GFAP）表达上调，而前脑标志物（PAX6）、祖细胞层标志物（SOX2）及多种神经元标志物（TUJ1, NeuN, ASCL1）表达下调，证实了缺血性脑损伤和神经细胞功能障碍。蛋白质组学分析鉴定出5100种蛋白，其中182种为差异表达蛋白（DEPs）。结果显示，缺血脑组织中凝血通路（如FGA, FGB, FGG蛋白上调）、免疫反应和氧运输相关蛋白被激活，而脂质代谢（如APOH, PLPPR1）、突触可塑性（如GRIN1, ARC）及轴突生成（如SLITRK1, MAP2）等神经系统发育相关蛋白则显著下调，这些分子变化解释了中风后学习记忆能力受损的现象。

为克服动物模型的局限性，研究的第二步是利用hiPSC在体外通过逐步分化策略构建人脑类器官，并将其暴露于缺氧环境（% O₂）以模拟人类卒中脑损伤。研究人员分别设置了缺氧8小时和24小时组，以模拟轻度和重度损伤。病理学分析显示，缺氧处理的人脑类器官出现了与小鼠模型一致的标志物变化。对该模型进行定量蛋白质组学分析，共鉴定出6987种蛋白。在缺氧8小时后，差异表达蛋白主要涉及囊泡循环、糖酵解（glycolysis）的上调，以及神经系统发育、细胞-基质粘附的下调。当缺氧延长至24小时，出现了更严重的变化，涉及表观遗传、染色质重塑和DNA损伤修复的核内生物过程相关蛋白显著上调，而能量代谢相关蛋白则全面下调。通过时间序列共表达分析，研究者发现多条与多巴胺能突触、神经营养因子相关的信号通路随缺氧时间延长处于过度激活状态，而脂肪酸代谢、碳代谢等能量代谢通路持续下降，并伴有氧化应激失调。这些结果系统描绘了体外卒中模型在蛋白质层面的损伤全景。

为获取高分辨率的细胞类型特异性分子特征，研究的第三步对缺氧处理0、1、8小时的脑类器官进行单细胞转录组（scRNA-seq）测序分析。根据特异性标志物，研究者成功鉴定出9种主要细胞类型，包括皮质兴奋性神经元（cortical excitatory neurons）、神经干细胞（neural stem cells）和三种不同的星形胶质细胞亚型（astrocyte 1, 2, 3）等。分析表明，在缺氧进程中，三种星形胶质细胞的数量持续增加，而皮质兴奋性神经元和神经干细胞数量减少。进一步针对不同细胞类型的差异表达基因（DEGs）进行功能模块分析，揭示了它们对缺氧损伤的特异性反应。星形胶质细胞1（astrocyte 1）在缺氧8小时后，特异性高表达与缺氧反应、凋亡、衰老相关的基因，同时其DNA损伤修复和微管基础过程相关基因低表达，提示其处于非健康状态。值得注意的是，后续的细胞外基质（ECM）分析发现，脑组织增生（tissue hyperplasia）相关的多数ECM成分（如COL6A3, IGFBP3等）在星形胶质细胞1中上调最显著，表明该亚型是导致卒中后脑组织增生的主要责任细胞。星形胶质细胞2（astrocyte 2）主要表现为翻译、线粒体ATP合成及有机物代谢过程的严重紊乱。星形胶质细胞3（astrocyte 3）则特异性高表达与炎症反应、体液免疫相关的基因，表明其主要功能是介导炎症因子产生以对抗脑损伤。对于神经元和干细胞，皮质兴奋性神经元在缺氧后持续高表达与凋亡和糖异生相关的基因，揭示了其损伤和凋亡风险；而神经干细胞同样显示出凋亡和衰老信号的富集，解释了其数量减少的原因。

研究的最后一步，是评估传统中药灯盏生脉胶囊（DZSM）的治疗效果及其潜在机制。研究人员制备了DZSM肠吸收液，并对MCAO小鼠模型进行灌胃治疗。结果显示，DZSM治疗能显著缩小脑梗死面积，并改善小鼠的神经功能缺损评分（mNSS）。蛋白质组学分析显示，在缺血组中上调或下调的众多蛋白，经DZSM治疗后其表达趋向恢复至正常水平。这些被DZSM恢复的蛋白质高度富集于脂质代谢（如HMGCS2, DGKQ）、激素反应、细胞骨架组织（如CTNNA2, ARC）和神经系统发育（如CAMK2N1, TANC2）等生物学过程。这一发现表明DZSM能有效修复缺血导致的神经骨架结构和相关功能。网络药理学分析进一步揭示，DZSM中的39种已知化合物（如芹菜素、木犀草素、拟人参皂苷F11等）可靶向上述17种功能恢复的关键蛋白，通过调控脂质代谢、激素反应、细胞骨架组装和神经系统发育这四大功能模块，协同发挥对缺血缺氧性脑损伤的治疗作用。

结论与价值： 本研究成功建立了一个结合人脑类器官与多组学（蛋白质组学和单细胞转录组学）的新型实验平台，用于直接研究人类卒中机制和筛选药物。研究首次详细描绘了在人类特异性背景下，三种星形胶质细胞亚型对缺氧应激的差异化反应，并精准鉴定出导致卒中后脑组织增生的主要星形胶质细胞亚型。同时，该研究验证了中药复方灯盏生脉胶囊可通过多靶点、多通路恢复脑功能，尤其强调了调节脂质代谢是其潜在关键药效机制。该研究的科学价值在于突破了动物模型与人类临床之间的物种差异障碍，为深入理解脑实质细胞在缺氧状态下的分子病理学提供了前所未有的高分辨率图谱。其应用价值在于，所建立的脑类器官-多组学平台，为未来卒中药物的体外高通量筛选和药效评估提供了一种有前景、符合伦理且成本更优的新策略，对推动卒中治疗领域从实验室到临床的转化具有重要意义。

研究亮点： 首先，该研究将脑类器官与单细胞转录组学和蛋白质组学分析相结合，实现了在人类来源的模型中系统解码卒中损伤的细胞和分子复杂性。其次，精准识别并定义了三种不同功能命运的人类星形胶质细胞亚型在缺氧下的角色，特别是揭示了负责脑组织增生的主要细胞群体，这是仅通过动物模型难以获得的发现。此外，研究通过现代多组学数据，为传统中药复方灯盏生脉胶囊的“滋阴益气”理论提供了分子层面的实证支持，展示了一种将传统医学与现代前沿生物技术相结合以加速药物发现的新范例。