本文报告了一项原创性研究，作者是来自纽约市立大学城市学院生物医学工程系的Yunfei Li、David B. Shteyman和Bingmei M. Fu，哥伦比亚大学精神病学系的Zhixiong Sun、Huixiang Zhu、Yan Sun、Sander Markx和Bin Xu，以及哥伦比亚大学生物医学工程系的Kam W. Leong。该研究于2023年1月27日发表在期刊《Cells》上，文章标题为“Inhibition of Abl Kinase by Imatinib Can Rescue the Compromised Barrier Function of 22q11.2DS Patient-iPSC-Derived Blood–Brain Barriers”。

这项研究属于神经血管生物学与精神疾病交叉领域。22q11.2缺失综合征（22q11.2 deletion syndrome，22q11.2DS）是一种由22号染色体微缺失引起的遗传病，约三分之一的携带者会发展为精神分裂症，因此是研究精神分裂症的重要遗传模型。研究团队此前已证明，由22q11.2DS患者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）来源的脑微血管内皮细胞形成的诱导血脑屏障（induced blood–brain barrier，iBBB）在结构和功能上存在缺陷。本研究的核心科学问题是：缺失区域内的CRKL基因单倍剂量不足是否是导致血脑屏障功能受损的原因，以及通过药物抑制Abl激酶能否恢复屏障功能。CRKL是Abl酪氨酸激酶的主要底物，Abl/CRKL信号通路对内皮屏障功能至关重要。Imatinib（伊马替尼）是美国FDA批准的Abl激酶抑制剂，已被用于治疗多种与血管渗漏相关的疾病。因此，研究者假设伊马替尼可以通过抑制Abl激酶从而减少CRKL的磷酸化，增加其活性形式，进而修复22q11.2DS患者的血脑屏障功能。

研究的总体流程包括iBBB的建立、屏障功能检测、结构蛋白检测、蛋白质印迹分析和转录组测序。研究者使用了三对22q11.2DS患者和健康对照的iPSC系，其中两对来自NIMH资源库，第三对由哥伦比亚干细胞中心通过仙台病毒重编程获得。将iPSC分化为脑微血管内皮细胞后，以约每平方厘米5万个细胞的密度接种到Transwell滤膜上，在补充了1%血小板贫乏血浆来源血清、2% B-27、10 µM维甲酸和20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的内皮培养基中培养6至7天，直至跨内皮电阻（trans-endothelial electrical resistance，TEER）连续两天稳定，表明iBBB形成。在功能检测方面，使用EVOM2电阻仪测量TEER以反映屏障对离子和小分子的通透性；同时用FITC标记的葡聚糖70k（dextran-70k）测定大分子溶质通透性。在结构检测方面，通过免疫染色标记紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5，以及内皮糖萼的主要成分硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS），并用Zeiss LSM 800共聚焦显微镜成像，用ImageJ定量荧光强度。伊马替尼处理设置了2 µM、10 µM和50 µM三种浓度，处理时间为1小时或2小时。在分子机制研究方面，用10 µM伊马替尼处理细胞2小时后提取总蛋白，通过蛋白质印迹检测总CRKL和磷酸化CRKL（pCRKL）水平，以pCRKL/总CRKL比值反映CRKL活化状态。转录组分析则对3例对照和3例患者来源的内皮细胞在有无伊马替尼处理的四种条件下进行批量RNA测序，使用iDEP平台和DESeq2进行差异表达分析，错误发现率（false discovery rate，FDR）小于0.05且倍数变化大于1.2的基因被定义为显著差异表达基因。随后进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析和KEGG通路分析。

研究结果显示，22q11.2DS iBBB的TEER仅为对照iBBB的64%至73%，而伊马替尼在2至50 µM浓度下处理1小时或2小时均可将TEER恢复到对照水平。与此同时，伊马替尼对健康对照iBBB的TEER没有显著影响。对于大分子通透性，22q11.2DS iBBB对葡聚糖70k的通透性是对照的1.3至1.5倍，伊马替尼处理2小时可使通透性降至对照水平，但处理1小时不能达到恢复效果，说明大分子屏障的恢复具有时间依赖性。在结构层面，22q11.2DS iBBB中ZO-1和Claudin-5的荧光强度显著低于对照，伊马替尼处理2小时可恢复这些紧密连接蛋白至对照水平。同时，22q11.2DS iBBB的内皮糖萼HS强度仅为对照的25%至55%，伊马替尼处理2小时可恢复HS强度，但处理1小时无效。这些结果表明伊马替尼能够同时修复紧密连接和内皮糖萼，从而恢复屏障功能。在分子水平上，22q11.2DS内皮细胞中总CRKL和pCRKL水平均显著低于对照。伊马替尼处理虽然不改变总CRKL蛋白水平，但显著降低pCRKL水平，因此pCRKL/总CRKL比值显著下降，说明伊马替尼通过抑制Abl激酶增加了活性形式的CRKL。转录组分析进一步显示，伊马替尼处理后共有473个基因上调和349个基因下调。下调基因主要富集在有丝分裂纺锤体组织、微管细胞骨架组织和有丝分裂核分裂等细胞周期相关过程，这与伊马替尼作为抗癌药物的作用一致。上调基因则富集在磷酸化、细胞蛋白修饰过程和蛋白修饰过程等通路中。KEGG通路分析发现，上调最显著的通路包括黏着斑（focal adhesion）、PI3K-Akt信号通路和紧密连接（tight junction）通路。将差异基因映射到这些通路上后发现，CRKL信号通路相关基因在22q11.2DS中下调，但在伊马替尼处理后上调；同样，ZO-1、Claudins和Occludin等紧密连接基因也在伊马替尼处理后上调。这些结果从转录水平支持了伊马替尼通过Abl/CRKL信号通路改善紧密连接蛋白表达和屏障功能的分子机制。

本研究的结论是，Abl激酶抑制剂伊马替尼可以恢复22q11.2DS患者来源iBBB的屏障完整性和功能。伊马替尼通过抑制Abl激酶活性，降低CRKL的磷酸化水平，增加活性形式CRKL，从而增强细胞黏附相关基因表达，促进紧密连接蛋白的产生和组装。这一发现首次将CRKL单倍剂量不足与22q11.2DS相关的血脑屏障功能障碍直接联系起来，并证明了药物干预的可行性。从科学价值上看，该研究揭示了一种与22q11.2DS相关的新疾病机制，为理解精神分裂症中血脑屏障异常提供了新视角。从应用价值上看，伊马替尼作为一种已在临床使用多年的药物，有望被重新用于改善22q11.2DS患者的血脑屏障功能，从而可能对神经发育产生积极影响。

本研究的亮点包括几个方面。首先，研究首次证明伊马替尼能够在人源iBBB模型中恢复22q11.2DS患者的血脑屏障功能，这是此前未被报道的。其次，研究将功能学检测、结构学检测、蛋白质水平和转录组水平的多层次证据整合在一起，形成了从宏观屏障功能到微观分子通路的完整证据链。第三，研究发现伊马替尼对健康对照iBBB没有显著影响，而对受损屏障具有修复作用，这一选择性效应具有重要的临床意义，因为它提示在治疗剂量范围内伊马替尼不太可能损害正常血脑屏障。此外，研究还发现伊马替尼对紧密连接和糖萼的恢复时间不同，前者在1小时内即可恢复，后者需要2小时，这提示不同屏障结构组分的修复机制和时间窗口存在差异。最后，研究中关于细胞接种密度的优化结果也具有方法学参考价值，即对于22q11.2DS患者来源的内皮细胞，较低接种密度反而能获得更稳定的屏障模型，而高接种密度会导致细胞死亡。