单细胞mRNA与蛋白分子数字化计数新方法：DMF-Bimol技术平台研究报告
一、 研究者与发表信息
本研究由厦门大学化学化工学院、医学院、能源材料化学协同创新中心、固体表面物理化学国家重点实验室的刘洋*、徐星*、杨朝勇*及其团队主要完成。合作者包括梁珊珊、李冲、宁宇、苏瑞、李明寅、黄奕豪、邹宇宁等。研究论文“DMF-Bimol: Counting mRNA and Protein Molecules in Single Cells with Digital Microfluidics”发表于美国化学会的《Analytical Chemistry》期刊，出版时间为2024年10月21日（网络先行版）。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、福建省自然科学基金等项目的资助。
二、 学术背景与研究目的
该研究属于生命分析化学与单细胞多组学技术交叉领域。细胞异质性广泛存在于生命体系中，对单个细胞同时进行多层面分子（如mRNA与蛋白质）的定量分析，是深入理解细胞功能、状态及其在发育、疾病等过程中作用的关键。然而，现有的单细胞mRNA与蛋白质联合分析方法面临诸多挑战：基于流式细胞术或质谱流式的方法（如Flow-FISH， CyTOF）通常只能提供相对定量，且对低丰度靶标的检测灵敏度有限；基于二代测序（NGS）的方法虽然灵敏度高，但常受非特异性抗体结合导致的高背景信号干扰；而基于数字邻近连接分析（digital Proximity Ligation Assay， dPLA）结合逆转录微滴数字PCR（RT-ddPCR）的技术，虽然能实现绝对定量，但传统操作流程中的样本稀释、手动操作繁琐、单细胞捕获效率低、以及可能存在的交叉污染等问题，限制了其灵敏度和通量。
因此，本研究旨在开发一种高灵敏度、自动化、可绝对定量单细胞内mRNA和蛋白质分子的新平台。具体目标包括：1）构建一个集成化、自动化的数字微流控（Digital Microfluidics， DMF）系统，以实现高效、灵活的单细胞捕获与处理；2）将数字微流控与邻近连接分析及一步法RT-ddPCR相结合，创建名为DMF-Bimol的新方法，实现对单个细胞内目标mRNA和蛋白质分子的数字化绝对计数；3）验证该平台在检测灵敏度和样本利用率方面的显著提升；4）应用该平台探索单细胞水平mRNA与蛋白质表达的相关性，并揭示其在疾病研究（如多发性骨髓瘤）中的潜在应用价值。
三、 详细研究流程
DMF-Bimol技术平台的工作流程是一个高度集成的自动化过程，主要包含以下关键步骤：
1. 数字微流控芯片设计与单细胞捕获： 研究团队设计并制造了一种基于介电润湿原理的数字微流控芯片。该芯片由上下两层板组成，中间填充绝缘油以防止液滴蒸发和交叉污染。底部板上集成有85个可独立寻址的驱动电极和11个用于储存试剂的储液池，通过程序化控制电极的开关状态，可以精确操控纳升至微升级别的液滴进行分配、移动、合并与分裂。为实现高效率的单细胞捕获，芯片上设计了直径200微米的亲水点。当细胞悬液液滴流经亲水点时，由于表面张力变化，会在亲水点上留下一个含有单个细胞的子液滴。这种被动分配方法具有高度灵活性，允许通过液滴操作移除非目标细胞并重新进行捕获，直至获得目标单细胞。该方法的单细胞捕获成功率超过95%，且30分钟的芯片操作后细胞活性仍保持在98.78%以上，保证了后续分析的可靠性。
2. 单细胞裂解与靶分子释放： 捕获到目标单细胞后，通过数字微流控操作，将含有裂解试剂的液滴移动并与包含细胞的液滴合并。研究优化了裂解缓冲液浓度（最终使用0.5倍浓度的TM缓冲液），以确保在彻底裂解细胞的同时，最大限度地保持mRNA的完整性，为后续的共检测奠定基础。
3. 基于数字微流控的蛋白质数字化分析（PLA反应）： 这是本研究的核心创新环节。细胞裂解后释放的蛋白质在芯片上的封闭纳升级液滴中进行邻近连接分析。首先，将预先制备的PLA探针（由偶联了特定寡核苷链的抗体组成）液滴与裂解物液滴合并，在37°C孵育60分钟，使抗体探针与目标蛋白的两个不同表位结合。随后，加入含有连接酶的液滴，在37°C孵育10分钟。当两个PLA探针因结合到同一个目标蛋白上而足够接近时，它们所携带的寡核苷链会在连接酶作用下连接起来，形成一段双链DNA（dsDNA）报告分子。此过程将蛋白质信号特异性地转化为DNA信号，有效避免了传统免疫检测中非特异性结合带来的背景干扰。最后，通过加入蛋白酶消化掉蛋白质，并经65°C加热灭活蛋白酶，反应液滴中仅留下代表原始蛋白拷贝数的dsDNA报告分子以及细胞内的mRNA。整个PLA反应在纳升级的封闭液滴中进行，显著提高了反应物的局部浓度，并隔离了外源污染物，从而极大提升了反应效率。
4. 分子回收与一步法RT-ddPCR定量： 完成芯片上所有反应步骤后，含有PLA产物（dsDNA）和mRNA的最终液滴被驱动至回收池，收集到离心管中。随后，将所有产物与一步法RT-ddPCR预混液混合，其中包括针对蛋白质来源dsDNA和靶标mRNA的不同荧光标记的TaqMan探针（例如，FAM标记用于蛋白质，VIC标记用于mRNA）。接着，利用液滴生成仪生成数千至数百万个油包水微滴，每个微滴包含0个、1个或多个靶标DNA分子。经过逆转录和PCR扩增后，通过微滴读取仪检测每个微滴的荧光信号。阳性微滴（含有扩增产物的微滴）的数量通过泊松统计校正，即可绝对计算出原始样品中靶标蛋白质（通过PLA转化的dsDNA）和mRNA的分子拷贝数。
5. 应用于真实临床样本分析： 为了展示DMF-Bimol的应用潜力，研究团队将其应用于多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma， MM）患者的骨髓样本分析。从患者骨髓样本中，使用CD138阳性分选试剂盒分离出骨髓瘤细胞（CD138+细胞），同时从上清液中收集白细胞作为对照。随后，使用DMF-Bimol平台分别对15个CD138+骨髓瘤细胞和15个白细胞进行单细胞分析，定量每个细胞内CD147蛋白及其mRNA的拷贝数，并计算蛋白质与mRNA的比值（翻译效率）。
四、 主要研究结果
1. 平台性能评估：超高灵敏度与低成本的蛋白质检测 首先，研究团队使用纯化的人CD147蛋白构建了蛋白质定量标准曲线。结果显示，DMF-Bimol方法对CD147蛋白的检测限（LOD）低至3313个分子，动态范围跨越3个数量级。与传统在微管中进行的台式PLA方法（LOD为55,385个分子）相比，灵敏度提高了17倍。同时，由于反应体积从微升级降至纳升级，试剂消耗量减少了47倍，显著降低了成本。该灵敏度也远高于传统的蛋白质印迹（Western Blot， LOD约27，000分子）和酶联免疫吸附测定（ELISA， LOD约583，940分子）。此外，对低丰度蛋白TNFR1的检测也获得了类似的高性能结果（LOD为4676个分子），证明了该方法适用于广泛丰度范围的蛋白质检测。
2. 单细胞蛋白质定量揭示细胞异质性 应用DMF-Bimol对K562、A549和HEK293T三种细胞系进行单细胞CD147蛋白定量。结果显示，单个K562、A549和HEK293T细胞中平均表达的CD147蛋白拷贝数分别为436，348 ± 279,963、357,881 ± 337,493和661,811 ± 630,206，不仅与已有报道水平相当，更重要的是揭示了巨大的细胞间异质性，这种异质性在群体平均测量（如1、10、100个细胞的平均值呈线性增长）中被掩盖。这凸显了单细胞分析的必要性。
3. 单细胞内mRNA与蛋白质的共定量及低相关性发现 研究成功实现了对同一批单个K562细胞内CD147 mRNA和蛋白质的同时数字化计数。单细胞mRNA计数的平均值为11.29 ± 8.33拷贝，同样显示出异质性。通过Gamma概率密度函数拟合，证明了基因表达的内在随机性。通过Spearman和Pearson相关性分析发现，单细胞水平的CD147 mRNA与蛋白质拷贝数之间的相关性很低（Spearman r = 0.255， Pearson r = 0.218）。这一相关系数远低于此前基于群体批量分析所报告的相关性（Pearson r = 0.41， 0.59）。这一关键结果表明，在群体水平观察到的mRNA与蛋白质的相关性可能被高估了，在单个细胞中，由于存在转录后调控、蛋白质状态变化、外部刺激等多种复杂因素，mRNA水平并不能准确预测其对应的蛋白质丰度。
4. 临床样本分析：揭示多发性骨髓瘤中CD147的翻译水平上调 对MM患者样本的分析得到了具有重要生物学意义的发现。DMF-Bimol分析显示，与正常白细胞相比，CD138+骨髓瘤细胞中的CD147蛋白表达水平急剧升高（骨髓瘤细胞：1,572，963 ± 3,092，778拷贝；白细胞：58，056 ± 61，302拷贝），且骨髓瘤细胞群体内蛋白表达的异质性更高。然而，令人惊讶的是，两者之间的CD147 mRNA表达水平却基本一致（均为约10拷贝）。计算翻译效率（蛋白拷贝数/mRNA拷贝数）后发现，骨髓瘤细胞的CD147翻译效率显著高于白细胞。这是首次在单细胞分辨率下直接观察到这一现象。结果表明，在多发性骨髓瘤细胞中，CD147蛋白的上调并非由于转录水平（mRNA）的增加，而是主要源于翻译效率的增强。这提示CD147的致癌性激活可能通过劫持蛋白质翻译机制来促进肿瘤细胞的存活和侵袭性，为针对CD147的靶向药物研发提供了新的思路和潜在的作用环节。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发并验证了DMF-Bimol这一创新型单细胞多组学分析平台。该平台通过数字微流控技术实现了单细胞的高效、灵活捕获与自动化处理，并结合高灵敏度的PLA与一步法RT-ddPCR，首次在封闭、纳升级的微反应体系中实现了对同一单个细胞内特定mRNA和蛋白质分子的绝对数字化计数。
其科学价值在于：1）提供了一种灵敏度极高（蛋白检测限低至数千分子）、成本更低、自动化程度高的单细胞蛋白质与mRNA共分析工具，克服了现有技术的多项瓶颈。2）通过精确的单细胞双参数测量，揭示了mRNA与蛋白质在单细胞水平的相关性远低于群体测量结果，强调了在异质性研究中必须进行单细胞分析的重要性，并为建立更精确的基因表达动力学模型提供了关键数据。3）展示了其在临床研究中的直接应用潜力。通过分析多发性骨髓瘤患者样本，发现了CD147蛋白在骨髓瘤细胞中通过翻译效率增强而上调的新机制，为理解肿瘤生物学和寻找新的治疗靶点提供了重要线索。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容与展望
论文指出，DMF-Bimol平台具有进一步拓展的潜力。未来，可通过使用针对不同蛋白复合物组分的抗体对，将该平台应用于单细胞水平的蛋白质-蛋白质相互作用研究。更长远地，该平台有望整合DNA、RNA和蛋白质的检测，实现从中心法则的转录到翻译全过程的单细胞整合多组学分析，为理解生命过程的复杂调控网络提供更强大的工具。平台所具有的液滴可寻址操作、灵活的单细胞分选、低吸附反应界面和纳升反应体积等特性，使其非常适合于广泛的单细胞多组学分析应用。