膜结合型白细胞介素-12免疫调节延缓卵巢癌致死性腹膜疾病的发作

作者：Courtney A. Cohen、Amanda A. Shea、C. Lynn Heffron、Eva M. Schmelz和Paul C. Roberts。研究机构：弗吉尼亚-马里兰兽医学院生物医学科学与病理生物学系，以及弗吉尼亚理工大学人类营养、食品与运动系。该研究发表于 *Journal of Interferon & Cytokine Research*，2016年第36卷第1期。

卵巢癌是致死率极高的妇科恶性肿瘤，其主要特点为早期无明显症状、缺乏有效的早期检测手段，以及确诊时往往已发生广泛的腹膜腔转移。卵巢癌细胞从原发肿瘤脱落并散布于腹膜腔后，最早期、最主要的转移种植部位是大网膜脂肪带（omental fat band，OFB）。OFB由脂肪组织与被称为“乳斑”的免疫细胞聚集区交错构成，乳斑中含有白细胞、干细胞、祖细胞、成纤维细胞和内皮细胞，这些成分合称为基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）。由于OFB在腹膜腔免疫监视以及固有免疫和适应性免疫应答中发挥重要作用，它被视为次级淋巴器官。卵巢癌细胞容易黏附于乳斑，并启动有利于肿瘤生长的微环境信号级联反应。既往研究表明，OFB中的中性粒细胞和巨噬细胞浸润与促肿瘤级联反应的建立密切相关。白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是重要的Th1型免疫调节因子，在多种肿瘤模型中表现出抗肿瘤活性，但全身给予可溶性IL-12常引起严重毒副作用，限制其临床应用。因此，开发能够局部、持续表达IL-12的策略具有重要意义。

本研究的目的是评估在肿瘤细胞表面直接表达膜结合型IL-12（membrane-bound IL-12，mbIL-12）能否调节OFB免疫微环境，延缓或抑制腹膜腔内卵巢癌的转移性生长。研究使用了小鼠卵巢表面上皮（mouse ovarian surface epithelial，MOSE）细胞模型，该模型来源于C57BL/6小鼠。研究者使用了具有不同转移潜能的MOSE细胞系：不致瘤的MOSE-E、缓慢致病的MOSE-LEGFPv，以及高侵袭性的MOSE-Lfflv。此外，研究者构建了稳定表达mbIL-12的MOSE-Lffl/IL-12v细胞系，其mbIL-12为小鼠单链IL-12 p35p40基因与流感病毒血凝素跨膜区融合而成，以确保IL-12持续表达于细胞表面。

在实验流程方面，研究者首先比较了不同转移潜能的MOSE细胞在腹腔注射后向OFB的定位动态。雌性C57BL/6小鼠经腹腔注射1×10⁶个MOSE-LEGFPv细胞，于注射后6小时和24小时取材，通过荧光显微镜观察OFB中的肿瘤细胞聚集情况；同时使用IVIS活体生物发光成像系统监测表达萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，ffl）的MOSE-Efflv和MOSE-Lfflv细胞在体内的分布与扩散。结果显示，无论是否具有致瘤性，所有MOSE细胞均在注射后6小时内迅速定位至OFB。非致瘤性MOSE-Efflv细胞在注射后第8天信号消失，提示其被宿主免疫防御清除或无法建立适合生存的微环境，而高侵袭性MOSE-Lfflv细胞则持续存在并广泛扩散。

随后，研究者验证了mbIL-12在MOSE-Lffl/IL-12v细胞表面的表达，并确认mbIL-12的表达不改变细胞的体外增殖速率，也不改变与促肿瘤微环境相关的细胞因子和趋化因子基因表达谱。体外实验中，MOSE-Lffl/IL-12v与亲代MOSE-Lfflv的增殖能力无显著差异。实时定量PCR（qRT-PCR）分析显示，两细胞系在多种细胞因子和趋化因子（如Cxcl12、Csf1、Ccl2、Ccl7等）的表达水平上基本一致，唯一致瘤性细胞系中中性粒细胞趋化因子Cxcl1和Cxcl5的表达显著高于非致瘤性MOSE-E细胞。这提示mbIL-12的抗肿瘤作用并非通过直接改变肿瘤细胞自身的增殖或分泌特性实现。

在体内疗效实验中，研究者首先以2.5×10⁶个MOSE-Lfflv或MOSE-Lffl/IL-12v细胞腹腔注射小鼠，15天后通过腹膜癌指数（peritoneal cancer index，PCI）评估肿瘤负荷。结果显示，接受mbIL-12表达细胞的小鼠肿瘤负荷显著低于亲代高侵袭性细胞组。随后，研究者以中等剂量（1×10⁶）或低剂量（1×10⁴）细胞进行生存期和肿瘤负荷比较。结果表明，接受1×10⁶个MOSE-Lffl/IL-12v细胞的小鼠生存期显著长于接受同等或低剂量亲代MOSE-Lfflv的小鼠；在注射后3周，接受1×10⁴个MOSE-Lffl/IL-12v细胞的小鼠肿瘤负荷显著低于接受同等剂量亲代细胞的小鼠，且与接受高100倍剂量的缓慢致病性MOSE-LEGFPv细胞的小鼠相当。这证明局部表达mbIL-12能够显著延缓致死性腹膜疾病的发展，但不能完全消除肿瘤。

为了探讨mbIL-12延缓疾病进展的免疫机制，研究者通过流式细胞术分析了OFB和腹膜浆液（peritoneal serous fluid，PSF）中的白细胞组成。结果显示，高侵袭性MOSE-Lfflv细胞的生长导致OFB中淋巴细胞比例显著下降，单核细胞/粒细胞比例显著上升；其中CD3⁺ T细胞、CD19⁺ B细胞和NK1.1⁺自然杀伤细胞比例显著减少，而F4/80⁺巨噬细胞和CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C⁺肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TAN）比例显著增加。相反，在接受MOSE-Lffl/IL-12v细胞的小鼠中，这些变化明显减弱，OFB中的TAN水平维持在对照组水平，且CD3⁺ T细胞比例甚至高于对照组。PSF中的变化趋势与OFB类似，MOSE-Lfflv注射导致淋巴细胞显著减少、巨噬细胞和TAN显著增加，而MOSE-Lffl/IL-12v注射则明显抑制了这些促肿瘤变化。

基因表达分析进一步支持了上述免疫细胞组成的变化。与PBS对照相比，MOSE-Lfflv小鼠OFB中Il2、Cxcl13、Il12、Ccl5、Cd36、Gmcsf和Tnfa等基因表达显著下降，而中性粒细胞趋化因子Cxcl1、Cxcl2和Cxcl5，以及单核细胞相关基因Arg1和Nos2的表达显著上升。重要的是，在MOSE-Lffl/IL-12v小鼠的OFB中，这些促肿瘤趋化因子的表达维持在对照水平。这说明mbIL-12能够抑制OFB中趋化信号的异常上调，从而减少TAN和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）的招募。

最后，研究者评估了mbIL-12是否能够增强肿瘤细胞的免疫原性，从而诱导针对后续肿瘤攻击的保护性免疫。实验使用丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）处理MOSE-Lfflv或MOSE-Lffl/IL-12v细胞，使其丧失增殖能力后注射小鼠。5周后，小鼠接受1×10⁴个高侵袭性MOSE-Lfflv细胞攻击。结果显示，无论事先是否暴露于携带mbIL-12的灭活细胞，小鼠均未获得对后续肿瘤攻击的保护作用。这表明MOSE细胞本身免疫原性很低，mbIL-12的表面表达并不能有效增强其诱导持久适应性免疫应答的能力。

本研究的结论是：在肿瘤细胞表面局部表达mbIL-12能够显著延缓卵巢癌腹膜转移的进展，减少OFB和腹膜腔中促肿瘤性的中性粒细胞与巨噬细胞浸润，并抑制相应趋化因子的表达。然而，这种保护作用是暂时性的，不能完全清除肿瘤，也无法诱导长期的保护性免疫。该研究提示，mbIL-12的抗肿瘤机制可能主要在于局部抑制促肿瘤微环境的形成，而非通过增强肿瘤免疫原性。研究还指出，腹膜腔和OFB中的常驻免疫细胞可能是IL-12免疫治疗的关键靶点；由于OFB在手术减瘤时常常被切除，未来需要进一步明确IL-12应答细胞是否依赖于OFB，以及能否从其他部位动员至腹膜腔。

本研究的亮点包括：利用mbIL-12实现了高度局部化的免疫调节，避免了可溶性IL-12全身给药引起的严重副作用；系统地比较了不同转移潜能肿瘤细胞对OFB和PSF免疫微环境的影响；通过流式细胞术和基因表达谱分析揭示了mbIL-12主要通过减少TAN和TAM浸润以及抑制趋化因子表达来延缓疾病进展；并通过MMC灭活细胞疫苗实验证实了MOSE细胞免疫原性低下，mbIL-12不能将其转化为有效疫苗。该研究为卵巢癌转移性疾病的免疫治疗提供了新的靶点思路，并为后续研究局部持续递送IL-12的策略奠定了基础。