关于LAG-3功能性配体鉴定的重要研究：稳定的pMHCII是调控自身免疫与抗肿瘤免疫的关键分子

一、 研究团队、发表信息与学术背景

本研究由日本东京大学定量生命科学研究所分子免疫学实验室的Takumi Maruhashi、Daisuke Sugiura、Il-Mi Okazaki等人主导，合作单位包括德岛大学、北海道大学等机构。通讯作者为Taku Okazaki教授。该研究于2022年5月10日发表在顶级免疫学期刊《Immunity》上，文章标题为《Binding of LAG-3 to stable peptide-MHC class II limits T cell function and suppresses autoimmunity and anti-cancer immunity》。

本研究属于免疫学领域，聚焦于免疫检查点（Immune checkpoint）分子的功能机制。淋巴细胞活化基因-3（Lymphocyte Activation Gene-3, LAG-3, CD223）是一个重要的抑制性共受体，与PD-1、CTLA-4等类似，在调节T细胞功能、防止自身免疫以及抑制抗肿瘤免疫中发挥关键作用。因此，LAG-3成为癌症免疫治疗和自身免疫病治疗中一个极具潜力的靶点。然而，自LAG-3被发现以来，其功能性配体（即能真正触发其抑制信号的分子）一直存在争议。早期研究认为LAG-3的主要配体是主要组织相容性复合体II类分子（MHC class II），但后续观察发现存在矛盾，例如某些表达MHCII的细胞无法结合LAG-3，且LAG-3的抑制作用可以不依赖CD4（MHCII的共受体）。近期研究揭示，LAG-3并非识别所有MHCII，而是特异性识别构象稳定的肽-MHCII复合物（stable peptide-MHC class II, stable pMHCII）。与此同时，另一个分子——纤维蛋白原样蛋白1（Fibrinogen-like protein 1, FGL1）也被鉴定为LAG-3的潜在配体，并被认为可能介导免疫抑制。这就引出了一个核心科学问题：在生理和病理条件下，究竟是stable pMHCII还是FGL1，或者两者共同作为LAG-3的功能性配体来抑制T细胞？阐明这一问题对于理解LAG-3的生物学功能、开发精准的靶向疗法至关重要。

因此，本研究的主要目标是：在体外和体内模型中，系统性地评估stable pMHCII和FGL1这两种潜在配体对LAG-3抑制功能的相对贡献，从而鉴定出LAG-3在自身免疫和抗肿瘤免疫背景下的功能性配体。

二、 详细研究流程与方法

本研究设计严谨，逻辑清晰，包含一系列相互关联的体外和体内实验，流程可概括为以下几个主要步骤：

步骤一：验证FGL1在体外T细胞活化模型中的作用 * 研究对象与处理：使用DO11.10（识别OVA肽的CD4+ T细胞杂交瘤）和BW-2C（识别QL9肽的CD8+ T细胞杂交瘤）细胞系，通过逆转录病毒转导使其表达野生型LAG-3（LAG-3-WT）或空载体对照。 * 实验设计：研究人员设计了两种抗原呈递细胞（APC）：一种（IIA1.6细胞）能形成稳定的pMHCII复合物，另一种（P815-CD80:I-Ad细胞）则不能。将表达或未表达LAG-3的T细胞与这两种APC共培养，并用特异性肽段刺激。 * 关键方法与测试：在共培养体系中，添加不同形式的重组FGL1蛋白（单体、Fc融合二聚体、COMP融合五聚体），通过检测上清液中IL-2的分泌水平（ELISA）和T细胞表面活化标志物（CD69, 4-1BB）的表达（流式细胞术），来评估FGL1是否能单独诱导或增强LAG-3的抑制功能。 * 数据分析：比较在有无FGL1存在的情况下，LAG-3-WT对T细胞活化的抑制程度是否发生变化。

步骤二：构建并筛选LAG-3配体结合缺陷型突变体 * 突变体构建： 1. pMHCII结合缺陷型：基于前期研究，使用已知的LAG-3-P111A突变体（无法结合pMHCII）。同时，通过定点突变筛选出另一个pMHCII结合缺陷突变体LAG-3-G103R。 2. FGL1结合缺陷型：对LAG-3的D1结构域进行易错PCR随机突变，构建突变库，转导入DO11.10细胞，然后通过流式细胞术分选无法结合COMP-FGL1的细胞，从中克隆出突变基因。最终鉴定出两个关键突变体：LAG-3-K27E和LAG-3-L14Q:V20A。 * 结合特性验证：使用流式细胞术和生物层干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）精确量化这些突变体与stable pMHCII四聚体及COMP-FGL1的结合亲和力（KD值）。同时，使用一系列针对LAG-3不同结构域的单克隆抗体（如TKB58, C9B7W等）进行竞争性阻断实验，绘制LAG-3上两个配体的结合表位图谱。 * 质谱分析成熟蛋白N端：为了解释L14Q:V20A突变导致FGL1结合丧失的机制，研究人员采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合平行反应监测（PRM）技术，精确测定了野生型和突变型LAG-3成熟蛋白的N端起始氨基酸，从而确定了信号肽切割位点。

步骤三：在体外功能实验中评估突变体的抑制能力 * 研究对象：表达LAG-3-WT、pMHCII结合缺陷突变体（P111A, G103R）或FGL1结合缺陷突变体（K27E, L14Q:V20A）的DO11.10和BW-2C T细胞。 * 实验与测试：将这些细胞与能形成stable pMHCII的IIA1.6 APC共培养并进行刺激。不添加外源FGL1，直接检测IL-2分泌和活化标志物表达。 * 数据分析：比较不同突变体与LAG-3-WT在抑制T细胞活化方面的效力，确定哪种结合能力对于LAG-3的抑制功能是必需的。

步骤四：在自身免疫疾病模型中验证配体的功能 * 动物模型构建：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了两种基因敲入小鼠模型，并将其培育到非肥胖糖尿病（Non-obese diabetic, NOD）小鼠背景上： 1. NOD-Lag3^p111a/p111a小鼠：携带LAG-3-P111A点突变（pMHCII结合缺陷，FGL1结合保留）。 2. NOD-Lag3^k27e/k27e小鼠：携带LAG-3-K27E点突变（FGL1结合缺陷，pMHCII结合保留）。 同时使用已报道的NOD-Lag3^-/-（LAG-3完全敲除）小鼠作为对照。 * 疾病监测与免疫分析： 1. 糖尿病发病监测：定期测量小鼠血糖，绘制糖尿病累积发病率曲线。 2. 胰岛浸润淋巴细胞分析：在糖尿病前期（8周龄）处死小鼠，分离胰岛浸润淋巴细胞，通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞的频率、IFN-γ产生能力（胞内染色）和增殖状态（Ki-67表达）。 3. 脾脏T细胞表型分析：分析脾脏中效应/记忆T细胞的比例。

步骤五：在抗肿瘤免疫模型中验证配体的功能 * 动物模型与处理：在C57BL/6小鼠背景上构建Lag3^p111a/p111a和Lag3^-/-小鼠。给这些小鼠皮下接种MC38结肠癌细胞。 * 肿瘤生长监测与免疫分析： 1. 肿瘤生长曲线：定期测量肿瘤体积。 2. 肿瘤浸润淋巴细胞分析：在接种后第9天分离肿瘤组织，制备单细胞悬液，通过流式细胞术定量肿瘤内CD4+ Foxp3+ 调节性T细胞（Treg）、CD4+ Foxp3- 常规T细胞（Tconv）和CD8+ T细胞的绝对数量，并分析Tconv和CD8+ T细胞中IFN-γ+和Ki-67+细胞的比例。

三、 主要研究结果及其逻辑关系

1. FGL1在体外不能诱导或增强LAG-3的抑制功能：在DO11.10和BW-2C T细胞活化实验中，无论APC提供的是稳定的还是不稳定的pMHCII信号，添加任何形式的重组FGL1蛋白均不能增强LAG-3-WT的抑制效果，也不能在缺乏stable pMHCII的情况下单独引发LAG-3的抑制。这表明，在经典的T细胞活化模型中，FGL1结合本身不足以触发LAG-3的抑制信号。

2. 成功构建并鉴定出配体结合特性分离的LAG-3突变体：

   • LAG-3-P111A和G103R：完全丧失与stable pMHCII四聚体的结合能力，但与COMP-FGL1的结合能力与野生型相当。
   • LAG-3-K27E和L14Q:V20A：几乎完全丧失与FGL1的结合能力，但与stable pMHCII的结合能力完好。质谱分析揭示，L14和V20位于信号肽内，其突变改变了信号肽切割位点，导致成熟蛋白N端起始氨基酸改变，从而影响了FGL1结合。K27E突变则直接破坏了与FGL1结合的关键正电荷。
   • 表位图谱：抗体阻断实验表明，stable pMHCII和FGL1结合在LAG-3上位置相近但并不完全重叠（主要涉及D1结构域，部分涉及D2），且两者不相互竞争结合。

3. 体外功能实验证明pMHCII结合是必需的，而FGL1结合是多余的：在T细胞活化实验中，表达pMHCII结合缺陷突变体（P111A, G103R）的T细胞完全失去了抑制功能，其IL-2产生和活化标志物表达与空载体对照无差异。相反，表达FGL1结合缺陷突变体（K27E, L14Q:V20A）的T细胞，其抑制能力与表达LAG-3-WT的T细胞完全相当。这一结果清晰地表明，LAG-3抑制T细胞活化 strictly依赖于其与stable pMHCII的结合，而与FGL1的结合无关。

4. 在自身免疫病模型中，破坏pMHCII结合（而非FGL1结合）完全模拟了LAG-3缺失的表型：

   • NOD-Lag3^p111a/p111a小鼠：与Lag3^-/-小鼠一样，糖尿病发病显著加速且发病率升高。其胰岛中浸润的CD4+和CD8+ T细胞数量更多，活化程度（IFN-γ产生、增殖）也显著增强，与Lag3^-/-小鼠程度相似。
   • NOD-Lag3^k27e/k27e小鼠：糖尿病发病率、血糖水平、脾脏T细胞活化状态均与野生型NOD小鼠无显著差异。
   • 结论：在体内自身免疫背景下，LAG-3通过识别stable pMHCII来抑制致病性T细胞，从而延缓糖尿病发生。FGL1结合在此过程中既不充分也不必要。

5. 在抗肿瘤免疫模型中，破坏pMHCII结合同样模拟了LAG-3缺失的表型：

   • C57BL/6-Lag3^p111a/p111a小鼠：接种MC38肿瘤后，肿瘤生长受到显著抑制，其抑制程度与Lag3^-/-小鼠相当。
   • 免疫分析：在Lag3^p111a/p111a和Lag3^-/-小鼠的肿瘤中，浸润的常规CD4+ T细胞（Tconv）数量及其活化（IFN-γ+）和增殖（Ki-67+）比例均显著高于野生型小鼠。CD8+ T细胞的数量和活化状态虽有增加趋势但未达统计学显著性（作者推测可能与MC38模型特性有关）。调节性T细胞数量无变化。
   • 结论：在抗肿瘤免疫中，LAG-3同样主要通过识别stable pMHCII来抑制肿瘤特异性T细胞（尤其是CD4+ Tconv细胞）的功能，从而削弱抗肿瘤免疫。FGL1结合在此过程中的必要性未被直接证明，但鉴于P111A突变已能完全重现LAG-3缺失的抗肿瘤增强效应，FGL1的作用即便存在也非主要。

四、 研究结论与意义

本研究得出明确结论：在调控T细胞介导的自身免疫和抗肿瘤免疫中，稳定的肽-MHCII复合物（stable pMHCII）是LAG-3的功能性配体，而FGL1的结合对于LAG-3发挥其抑制功能既非充分也非必要。

科学价值： 1. 解决了长期争议：厘清了关于LAG-3配体的困惑，确立了stable pMHCII作为其关键功能性配体的地位，为理解LAG-3的生物学作用提供了清晰的分子基础。 2. 阐明了作用机制：揭示了LAG-3通过识别由专职抗原呈递细胞（如B细胞、树突状细胞）表面的稳定pMHCII，在免疫突触局部对识别同一抗原的T细胞（尤其是CD4+ T细胞）进行“顺式”（cis）抑制，这是一种高度特异性和情境依赖性的调控方式。 3. 修正了先前观点：对认为FGL1是LAG-3主要功能性配体的观点提出了强有力的挑战。本研究指出，先前研究中观察到的FGL1的微弱抑制效应可能在实验系统敏感性、或存在其他FGL1结合分子等因素影响下被放大解读。

应用价值： 1. 为药物开发提供新靶点与策略：该研究指出，靶向stable pMHCII-LAG-3相互作用的药物（如阻断抗体、诱饵受体）可能比泛泛地靶向LAG-3或FGL1更具特异性和有效性。同时，也提示在开发LAG-3激动剂（用于治疗自身免疫病）时，应着重于增强其与stable pMHCII的结合或下游信号。 2. 指导精准免疫治疗：有助于预测哪些患者（其肿瘤或自身免疫靶组织高表达稳定pMHCII）可能对LAG-3靶向治疗更敏感。 3. 揭示了新的生物学问题：既然FGL1不是T细胞上LAG-3的主要功能性配体，那么它在体内与谁结合、有何功能？这为后续研究开辟了新方向。

五、 研究亮点

1. 精妙的遗传学模型：研究没有停留在基因敲除层面，而是创新性地使用了“功能分离”的点突变敲入小鼠模型（Lag3^p111a/p111a 和 Lag3^k27e/k27e），能够在保留蛋白质表达和整体结构的前提下，精确地剥离LAG-3的某一种配体结合能力，从而在完整的生理环境中进行因果论证，这是本研究的核心方法论亮点。
2. 系统性与多层次验证：研究从体外生化结合、细胞功能实验，到两种重要的体内疾病模型（自身免疫病和癌症），构成了一个完整、严谨的证据链，结论坚实可靠。
3. 分子机制解析深入：不仅发现了突变，还通过质谱、BLI等技术深入阐明了突变导致表型变化的分子结构基础（如信号肽切割位点改变、关键电荷相互作用）。
4. 挑战并推进了领域认知：敢于对已有主流观点（FGL1作为主要配体）提出质疑，并通过扎实的数据给出了新的答案，推动了领域发展。

六、 其他有价值的内容

• 研究揭示了LAG-3对CD8+ T细胞也存在“APC类型特异性抑制”，即仅当APC同时表达稳定的pMHCII和呈递抗原的MHCI时，LAG-3才能抑制CD8+ T细胞，这扩展了对LAG-3抑制范围的理解。
• 研究指出，抗LAG-3抗体C9B7W（在先前FGL1研究中使用的关键抗体）实际上能同时阻断LAG-3与pMHCII和FGL1的结合，因此其体内抗肿瘤效果不能简单归因于阻断了FGL1-LAG-3通路。
• 作者在讨论中也客观指出了本研究的局限性：例如，由于技术限制，未能获得完全特异性只阻断FGL1-LAG-3相互作用的抗体或突变体，因此不能完全排除FGL1在特定情况（如非T细胞类型）或与pMHCII协同中发挥次要作用的可能性。这为未来研究留下了空间。

这项研究通过一系列设计巧妙的实验，有力地证明了stable pMHCII是LAG-3在调控T细胞介导的自身免疫和抗肿瘤免疫中的关键功能性配体，为理解和靶向这一重要的免疫检查点分子奠定了新的理论基础。