PD-1与LAG-3协同调控CD8+ T细胞耗竭及抗肿瘤免疫的机制研究

一、作者与发表信息
本研究由美国匹兹堡大学医学院免疫学系的Lawrence P. Andrews、Samuel C. Butler、Jian Cui等领衔，联合哈佛医学院、宾夕法尼亚大学等机构的多位学者共同完成，于2024年8月8日发表于顶级期刊《Cell》（卷187，页4355–4372）。通讯作者为Dario A.A. Vignali（dvignali@pitt.edu）。

二、学术背景
免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/LAG-3）在肿瘤治疗中展现出显著疗效，但联合阻断PD-1和LAG-3的协同机制尚不明确。PD-1（程序性死亡蛋白1）和LAG-3（淋巴细胞激活基因3）是T细胞表面共表达的抑制性受体（Inhibitory Receptors, IRs），在慢性病毒感染和肿瘤微环境中驱动T细胞耗竭（Exhaustion）。尽管FDA已批准抗PD-1（Nivolumab）与抗LAG-3（Relatlimab）联合治疗黑色素瘤（RELATIVITY-047临床试验显示优于单药），但其分子机制亟待解析。本研究旨在揭示PD-1与LAG-3如何协同调控CD8+ T细胞功能，并探索其对抗肿瘤免疫的影响。

三、研究流程与方法
1. 模型构建与验证
- 基因敲除小鼠：构建条件性敲除小鼠（pdcd1l/l和lag3l/l-yfp），通过E8iCre限制性删除CD8+ T细胞的PD-1和/或LAG-3，验证其基线免疫表型（图S1）。
- 肿瘤模型：采用B16-F10（黑色素瘤）和B16-gp100（表达gp100抗原）移植瘤模型，分析肿瘤生长及T细胞浸润（图1a-d）。

1. 单细胞多组学分析

   • 单细胞RNA测序（scRNA-seq）与TCR测序（scTCR-seq）：分离肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），鉴定转录组差异和TCR克隆性。UMAP聚类揭示9个CD8+ T细胞亚群，重点关注效应记忆样（Cluster 0）和干扰素响应（Cluster 7）群体（图2a-g）。
     
   • 数据整合：结合Polyclonal（多克隆）和Pmel（gp100特异性单克隆）T细胞数据，分析基因表达网络（图S3）。
     

2. 功能验证实验

   • NKG2A调控：发现PD-1/LAG-3缺失导致NKG2A（Klrc1基因编码）在单克隆系统中上调，而在多克隆系统中下调（图3a-i）。通过shRNA敲低Klrc1，验证其限制抗肿瘤功能（图3n-o）。
     
   • IFN-γ信号通路：检测IFN-γ分泌（图6a-c）、IFN-γR1表达（图6d）及下游基因（Ccl5、Tbet、ICOS），并通过中和抗体和Ifngr1敲除验证其自分泌作用（图6h-m，图7）。
     

3. 临床样本分析

   • 黑色素瘤患者外周血单核细胞（PBMCs）显示，Relatlimab+Nivolumab联合治疗上调肿瘤特异性CD8+ T细胞的NKG2A+CD94+比例（图3j-m）。
     

四、主要结果
1. 协同抗肿瘤效应
- PD-1/LAG-3双敲除CD8+ T细胞显著抑制B16-gp100肿瘤生长（图1e-f），且联合抗体治疗优于单药（图1i-j）。
- 机制上，双敲除T细胞表现为：
- 转录重编程：富集效应记忆和干扰素响应基因（如Gzmb、Ifng、Stat1）（图2d）。
- 克隆多样性增加：scTCR-seq显示TCR库更广泛，但NKG2A缺失可能削弱多克隆系统的疗效（图4a-f）。

1. 耗竭调控的独特机制

   • LAG-3主导调控Tox（耗竭关键转录因子）表达，而PD-1缺失促进终末耗竭表型（Ly108-Tim3+）（图5g-j）。
     
   • 双敲除T细胞表现为中间耗竭状态（Ly108+Tim3+），伴随Tcf1+干细胞样群体扩增（图5i-j）。
     

2. IFN-γ的自分泌作用

   • PD-1/LAG-3缺失增强IFN-γ分泌，通过细胞内在信号（非肿瘤细胞依赖）激活抗肿瘤功能（图6k-m）。Ifngr1敲除完全逆转疗效（图7d）。
     

五、结论与意义
本研究首次阐明PD-1与LAG-3通过以下途径协同调控CD8+ T细胞：
1. 双重抑制：PD-1靶向CD28信号，LAG-3干扰TCR-CD3-LCK结合，共同促进耗竭程序。
2. NKG2A的双向调控：在抗原特异性T细胞中上调NKG2A限制疗效，提示联合抗NKG2A（如Monalizumab）的潜在价值。
3. IFN-γ自分泌环路：为联合免疫治疗提供新靶点。

科学价值：
- 为PD-1/LAG-3联合治疗的临床优势提供机制解释。
- 提出“耗竭程序可逆性”新观点，挑战传统Tox主导的耗竭范式。

应用价值：
- 指导优化免疫联合策略（如三联阻断PD-1/LAG-3/NKG2A）。
- 支持TCR-T细胞治疗中基因编辑PD-1/LAG-3的可行性。

六、研究亮点
1. 方法创新：整合多克隆/单克隆模型、scRNA-seq/scTCR-seq、临床样本验证，形成闭环证据链。
2. 发现新颖性：
- LAG-3在耗竭中的主导作用（优于PD-1）。
- IFN-γ的自分泌功能突破传统“肿瘤细胞杀伤”认知。
3. 转化意义：直接关联RELATIVITY-047临床试验结果，推动精准免疫治疗。

七、其他价值
- 揭示NKG2A作为预测联合治疗响应的潜在生物标志物。
- 提出TCR克隆多样性对抗肿瘤疗效的双刃剑效应，为个体化治疗提供理论依据。

（注：全文涉及术语首次出现均标注英文，如耗竭（Exhaustion）、抑制性受体（Inhibitory Receptors, IRs）等。）