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本研究的主要作者包括Yanping Yang、Yogindra Vedvyas、Yago Alcaina、Sydney J. Trumper、Diella S. Babu、Irene M. Min、Jacqueline M. Tremblay、Charles B. Shoemaker和Moonsoo M. Jin。他们分别来自Houston Methodist Research Institute、Weill Cornell Medicine和Tufts University等机构。该研究于2024年11月22日发表在期刊JCI Insight上，文章标题为《Affinity-Tuned Mesothelin CAR T Cells Demonstrate Enhanced Targeting Specificity and Reduced Off-Tumor Toxicity》。
本研究属于免疫治疗领域，特别是嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells, CAR-T）疗法。CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但在实体瘤中的应用面临诸多挑战，尤其是“靶向-脱靶毒性”（on-target, off-tumor toxicity），即CAR-T细胞攻击表达目标抗原的正常组织。Mesothelin（MSLN）是一种在多种实体瘤中高表达的糖蛋白，但在正常组织中表达较低，因此成为CAR-T疗法的潜在靶点。然而，高亲和力的MSLN CAR-T细胞在临床试验中引发了严重的肺毒性甚至患者死亡。因此，本研究旨在通过调节CAR-T细胞的亲和力，优化其对肿瘤的靶向性，同时减少对正常组织的毒性。
本研究包括以下几个主要步骤：
MSLN特异性单域抗体的筛选与鉴定
研究团队通过免疫羊驼，获得了能够同时结合人类和小鼠MSLN的单域抗体（Variable Heavy domain of Heavy chain-only antibody, VHH）。通过噬菌体展示技术筛选出多个克隆，并进一步鉴定其亲和力。最终选择了亲和力最强的克隆JZQ-B4，并对其进行了系统性的亲和力调节。
单域抗体的亲和力调节
研究团队利用酵母表面展示系统，对JZQ-B4的互补决定区（Complementarity-Determining Regions, CDRs）进行单氨基酸替换（丙氨酸扫描），生成了一系列亲和力不同的VHH变体。通过流式细胞术检测这些变体与MSLN的结合能力，筛选出亲和力显著降低的变体（如T2A、R3A、Y4A和N9A）。
CAR-T细胞的构建与体外功能验证
将筛选出的VHH变体构建为CAR-T细胞，并评估其体外杀伤效果。研究团队使用不同MSLN表达水平的肿瘤细胞系，测试了这些CAR-T细胞的细胞毒性。结果显示，低亲和力的N9A CAR-T细胞表现出对高MSLN表达肿瘤细胞的特异性杀伤，而对低表达细胞则无明显毒性。
体内实验评估CAR-T细胞的疗效与毒性
研究团队在小鼠模型中评估了不同亲和力CAR-T细胞的抗肿瘤效果和毒性。通过PET/CT成像和流式细胞术，监测了CAR-T细胞在体内的分布和扩增情况。结果显示，高亲和力的CAR-T细胞在小鼠肺部、肝脏和骨髓中大量扩增，引发了严重的系统性毒性；而低亲和力的N9A CAR-T细胞则主要局限于肿瘤部位，表现出更好的安全性和抗肿瘤效果。
数据分析与统计
研究团队通过流式细胞术、ELISA、PET/CT成像等多种技术手段，对实验数据进行了系统性分析。采用ANOVA和Kaplan-Meier生存分析等统计方法，评估了不同CAR-T细胞变体的疗效和毒性差异。
MSLN特异性单域抗体的筛选与鉴定
研究团队成功筛选出能够同时结合人类和小鼠MSLN的VHH克隆JZQ-B4，其对人MSLN的亲和力为亚纳摩尔级别，对小鼠MSLN的亲和力为纳摩尔级别。
单域抗体的亲和力调节
通过丙氨酸扫描，研究团队生成了多个亲和力不同的VHH变体。其中，N9A变体对人MSLN的亲和力降低了约500倍，但仍保持对小鼠MSLN的交叉反应性。
CAR-T细胞的体外功能验证
低亲和力的N9A CAR-T细胞表现出对高MSLN表达肿瘤细胞的特异性杀伤，而对低表达细胞则无明显毒性。相比之下，高亲和力的CAR-T细胞对低表达细胞也表现出强烈的杀伤作用。
体内实验评估CAR-T细胞的疗效与毒性
高亲和力的CAR-T细胞在小鼠体内引发了严重的系统性毒性，而低亲和力的N9A CAR-T细胞则表现出更好的安全性和抗肿瘤效果。PET/CT成像显示，N9A CAR-T细胞主要局限于肿瘤部位，而高亲和力CAR-T细胞则在正常组织中大量扩增。
本研究通过调节CAR-T细胞的亲和力，成功优化了其对MSLN高表达肿瘤细胞的靶向性，同时显著减少了对正常组织的毒性。低亲和力的N9A CAR-T细胞在体内外实验中均表现出优异的抗肿瘤效果和安全性，为实体瘤的CAR-T疗法提供了新的策略。
科学价值
本研究首次系统性地研究了CAR-T细胞亲和力对其靶向性和毒性的影响，揭示了低亲和力CAR-T细胞在实体瘤治疗中的潜在优势。
应用价值
研究结果为开发更安全、更有效的CAR-T疗法提供了重要依据，尤其是在实体瘤治疗中的应用前景广阔。
重要观点
研究强调了CAR-T细胞亲和力调节的重要性，提出了一种通过单氨基酸替换优化CAR-T细胞功能的新方法。
重要发现
低亲和力的CAR-T细胞能够显著减少“靶向-脱靶毒性”，同时保持对肿瘤细胞的高效杀伤。
方法创新
研究团队开发了基于酵母表面展示系统的亲和力调节方法，并通过丙氨酸扫描成功筛选出低亲和力CAR-T细胞变体。
研究对象的特殊性
本研究首次利用能够同时结合人类和小鼠MSLN的单域抗体，为CAR-T细胞的临床前评估提供了更可靠的动物模型。
研究团队还提出，未来可以通过进一步优化CAR-T细胞的亲和力和功能，结合其他免疫治疗策略（如IL-12局部递送），进一步提升CAR-T细胞在实体瘤治疗中的效果。
这篇报告详细介绍了研究的背景、方法、结果和意义，为其他研究者提供了全面的参考。