本研究由复旦大学、中山医院、复旦大学附属儿科医院、广州医科大学等多个单位的研究人员合作完成，发表于2025年的《自然-通讯》杂志。研究团队包括第一作者彭程王、紫乔王、飞冯、丽莎尹等，以及通讯作者宋春、赵金存、张荣。
本研究属于病毒学与宿主-病原体相互作用领域，聚焦于常见人类冠状病毒HCoV-229e。尽管HCoV-229e通常引起普通感冒症状，但在老年和免疫功能低下人群中可能导致严重的下呼吸道感染，甚至肺炎和急性呼吸窘迫综合征。此外，与主要感染呼吸道上皮细胞的其他冠状病毒不同，HCoV-229e能够高效入侵并感染原发性肺泡巨噬细胞和单核细胞，这可能促进病毒扩散和全身性病理。人类氨基肽酶N是HCoV-229e进入宿主细胞的已知受体。然而，对于调控宿主对这类冠状病毒易感性，特别是与年龄相关的易感性增加的宿主内在因素，我们知之甚少。因此，本研究旨在通过全基因组筛选，识别限制HCoV-229e感染的宿主因子，并阐明其作用机制，从而深入理解冠状病毒的致病机理和与年龄相关的疾病进展。
研究主要包含五个相互关联的部分，流程从表型筛选到机制探索，再到临床相关性验证，逻辑严密。
第一部分：全基因组CRISPR敲除筛选与UHRF1的发现。 为了系统性识别限制HCoV-229e感染的宿主因子，研究团队在A549细胞（一种肺腺癌细胞系，本身对HCoV-229e感染效率很低）中进行了全基因组的CRISPR-Cas9敲除筛选。他们使用了一种经过改造的HCoV-229e病毒，其NS4a基因被绿色荧光蛋白报告基因替换，以便通过流式细胞术分选被感染的细胞。将覆盖19，114个基因的sgRNA文库导入稳定表达Cas9的A549细胞，建立敲除文库。随后用HCoV-229e病毒感染文库细胞，感染24小时后，分选出报告基因阳性的感染细胞群体，并对其基因组DNA进行二代测序，分析sgRNA的富集情况。使用MAGeCK软件进行数据分析，旨在寻找敲除后导致感染细胞比例升高的基因，即潜在的宿主限制因子。分析结果将泛素样含PHD和环指结构域蛋白1列为排名第一的候选基因。随后的验证实验证实，在A549细胞中敲除UHRF1能将HCoV-229e感染率从约1%显著提升至近80%，而UHRF1过表达则抑制感染，且这种限制效应与细胞毒性无关，可通过基因回补实验恢复。这表明UHRF1是HCoV-229e的一个强有力的宿主限制因子。
第二部分：UHRF1作用的特异性与机制初探。 研究首先测试了UHRF1对其他冠状病毒属的代表病毒的限制作用是否具有普遍性。实验发现，在敲除UHRF1后，多种冠状病毒包括SARS-CoV-2、HCoV-OC43、传染性支气管炎病毒和猪δ冠状病毒的感染率均有2-3倍的提升，但对另外两种α冠状病毒HCoV-NL63和SADS-CoV的提升效果不显著，部分原因是这些病毒在所用细胞系上的基础感染率过低。值得注意的是，与其他冠状病毒相比，UHRF1敲除对HCoV-229e感染的增强效应最为显著。有趣的是，对于其他不相关的RNA病毒，如寨卡病毒、辛德毕斯病毒、水疱性口炎病毒和流感病毒，UHRF1敲除反而抑制了它们的感染，这与先前报道的UHRF1作为先天免疫负调控因子的功能一致。进一步的实验排除了UHRF1通过干扰素信号通路发挥限制作用的可能性，因为在IPS-1和STAT1缺陷的细胞系中敲除UHRF1，仍然能增强HCoV-229e和SARS-CoV-2的感染。这暗示UHRF1限制冠状病毒感染可能存在独立于经典免疫通路的独特机制。
接下来，研究聚焦于病毒感染的关键第一步——进入。利用表达不同冠状病毒刺突蛋白的水疱性口炎病毒假病毒系统，研究发现UHRF1敲除能大幅增强（超过30倍）携带HCoV-229e刺突的假病毒进入，对SARS-CoV-2假病毒的进入也有约1.6倍的增强，但抑制了携带VSV-G蛋白的假病毒进入，这与UHRF1促进VSV感染的结果相符。这确定了UHRF1在限制HCoV-229e进入环节的关键作用。随后的病毒结合与内化实验表明，与对照细胞相比，UHRF1敲除细胞表面结合的HCoV-229e病毒粒子更多，进入细胞内部的病毒量也增加了约4倍。
第三部分：机制深入——UHRF1通过表观遗传沉默受体APN表达。 基于UHRF1在DNA甲基化维持中的已知功能，研究团队推测其可能通过调控关键宿主因子的表达来发挥作用。他们发现，在多种细胞系中，UHRF1敲除均导致HCoV-229e的细胞进入受体APN的蛋白和mRNA水平显著上调，并且APN在细胞膜表面的表达也增加。时间进程实验显示，UHRF1敲除后，APN的表达上调存在延迟，暗示了转录水平的调控。
为了确认APN是UHRF1限制作用中的关键下游因子，研究进行了功能丧失和功能阻断实验。首先，在APN被敲除的A549克隆细胞中，再敲除UHRF1则无法再增强HCoV-229e感染。其次，用APN阻断抗体预处理UHRF1敲除细胞，几乎完全消除了其感染增强效应。这些结果直接证明，UHRF1主要通过下调APN受体表达来限制HCoV-229e感染。
随后，研究深入探究UHRF1下调APN表达的分子机制。实验排除了UHRF1通过促进APN蛋白降解的可能性。通过亚硫酸氢盐克隆测序，发现UHRF1敲除导致APN基因启动子区域的CpG位点甲基化水平从86.15%显著下降至42.23%。用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理细胞，能模拟UHRF1敲除的效果，诱导APN表达上调。相反，在APN高表达的Huh7细胞中稳定表达DNA甲基转移酶DNMT3a，则能降低APN mRNA水平和HCoV-229e感染。体外甲基化和双荧光素酶报告基因实验进一步证明，APN启动子的甲基化直接抑制了其转录活性。电泳迁移率变动分析表明，启动子甲基化减少了核蛋白与DNA探针的结合。染色质免疫沉淀实验则发现，UHRF1敲除促进了转录因子c-Maf与APN启动子的结合。这些数据共同揭示了UHRF1通过维持APN启动子的高甲基化状态，抑制转录因子结合，从而在转录水平沉默APN基因的表达。通过构建UHRF1不同结构域的截短体进行回补实验，研究还发现除TTD结构域外，UBL、PHD、SRA和RING结构域对于UHRF1限制HCoV-229e感染都是必需的，这与这些结构域在维持DNA甲基化中的已知功能相符。
第四部分：系统性探索UHRF1调控的其他促感染基因。 为了全面了解UHRF1调控的基因网络在冠状病毒感染中的作用，研究进行了RNA测序分析。在UHRF1敲除细胞中，有2210个基因表达上调，51个基因下调，APN是上调最显著的基因之一（约40倍）。为了从这些上调基因中系统性地筛选出对冠状病毒感染有促进作用的因子，研究团队构建了一个聚焦的CRISPR激活子文库，靶向这2210个基因中的2172个。在A549细胞中进行激活筛选后发现，对于HCoV-229e，除了APN排名第一外，唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素1和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Syndecan 2等已知能促进冠状病毒感染的基因也位列前茅。对于SARS-CoV-2，排名最高的基因是PLAC8，该基因已被报道是SARS-CoV-2的促感染因子。此外，研究还发现UHRF1敲除导致细胞表面和分泌的硫酸乙酰肝素水平增加，并且与硫酸乙酰肝素生物合成相关的基因表达上调。在硫酸乙酰肝素合成关键基因B3GAT3缺陷的细胞中，UHRF1敲除对SARS-CoV-2感染的增强效应被削弱。这些结果表明，UHRF1可能还通过调控其他广谱的病毒附着因子（如硫酸乙酰肝素）以及一些特定基因来发挥对多种冠状病毒的限制作用，但其核心机制和对HCoV-229e最突出的影响仍是通过抑制APN。
第五部分：年龄相关易感性的临床相关性验证。 研究的最终目标是解释UHRF1在老年人HCoV-229e易感性增加中的作用。通过对公共数据库的分析，研究发现无论是在群体转录组还是单细胞RNA测序数据中，肺组织中的UHRF1表达都随年龄增长而下降，而APN的表达则随年龄增长而上升，两者呈负相关。重要的是，APN主要在巨噬细胞和单核细胞中高表达，这与HCoV-229e易于感染这些细胞类型的现象一致。
为了直接验证这一相关性，研究团队从年轻和老年捐赠者的支气管肺泡灌洗液中分离了原代肺泡巨噬细胞进行实验。结果显示，与年轻组相比，老年组肺泡巨噬细胞中UHRF1的mRNA水平降低约50%，而APN的mRNA水平升高约4倍。相应地，在HCoV-229e感染后，老年组肺泡巨噬细胞内的病毒基因组拷贝数和上清液中的病毒滴度均显著高于年轻组，并且促炎细胞因子的产生也更多。对原代细胞APN启动子甲基化状态的分析进一步确认，老年个体的甲基化水平低于年轻个体。这些发现将体外机制与临床表型联系起来，证实了年龄相关的UHRF1表达下降导致APN启动子去甲基化和表达上调，从而使得肺泡巨噬细胞等靶细胞对HCoV-229e更易感。
本研究的主要结论是：UHRF1是宿主抵御冠状病毒感染的一个关键年龄相关限制因子。其核心机制在于通过维持病毒进入受体APN基因启动子的高甲基化状态，表观遗传性地沉默其表达，从而限制HCoV-229e的进入和感染。随着年龄增长，宿主肺组织（特别是肺泡巨噬细胞）中UHRF1表达下降，导致APN表达上调，增加了细胞对HCoV-229e的易感性，这可能是老年人感染后病情更严重的重要原因。
本研究的科学价值在于：首次揭示了UHRF1在冠状病毒感染中的独特限制作用，拓展了我们对宿主表观遗传调控在抗病毒防御中作用的理解。研究不仅阐明了从宿主因子筛选到具体表观遗传机制，再到临床年龄相关性验证的完整科学故事，还为理解常见冠状病毒在老年人群中的致病机理提供了新的视角。在应用价值方面，UHRF1-APN轴可能成为一个潜在的宿主导向治疗靶点，为开发针对冠状病毒（尤其是对老年人群威胁较大的毒株）的新型抗病毒策略提供了理论依据。
这项研究是一项从现象到机制再到临床意义的系统性高水平工作，极大地增进了我们对宿主如何通过表观遗传方式调控对冠状病毒易感性的认识，特别是在解释年龄相关的感染差异方面做出了重要贡献。