周浩（Hao Zhou）和金鹏鹤（Jinpeng He）为本文共同第一作者，来自中南大学湘雅三医院脊柱外科及南华大学附属南华医院关节外科与运动医学科。通讯作者为谭伟（Wei Tan）、帅词俊（Cijun Shuai）及邓幼文（Youwen Deng），分别来自中南大学湘雅三医院脊柱外科与中南大学机电工程学院。该研究于2024年3月15日在线发表于*Bioactive Materials*第37卷，页码51–71。
一、研究背景与目的
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）是导致颈肩痛及腰背痛的主要原因之一，全球超过三分之二人口受此类疼痛困扰。保守治疗仅能缓解症状，手术可能增加邻近节段病变风险。IVDD涉及活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度积累、细胞焦亡（pyroptosis）及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）降解等多重病理机制，单一靶点治疗效果有限。目前尚无获批的特异性分子治疗药物。
针对上述问题，本研究构建了一种多功能、微环境响应性金属-酚网络释放平台，命名为TMP@Alg-PBA/PVA。该平台将单宁酸（tannic acid, TA）、锰离子（Mn²⁺）和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVP）自组装形成的TA-Mn-PVP（TMP）纳米颗粒（nanoparticles, NPs）负载于由海藻酸钠（alginate, Alg）、苯硼酸（phenylboric acid, PBA）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）构成的ROS响应性水凝胶中。研究目的包括：评价TMP对IL-1β诱导的IVDD的疗效；通过ROS响应释放降低纳米溶液对脊髓等关键部位的风险；并探讨平台抑制细胞焦亡的分子机制。
二、研究流程与实验设计
研究首先收集了9例IVDD手术患者的退变髓核组织标本，患者年龄36至64岁，Pfirrmann分级为III级或以上。通过MRI、番红O-固绿染色、HE染色及免疫组化检测了ECM成分（II型胶原Col-II和聚集蛋白聚糖Aggrecan）及焦亡相关蛋白（NLRP3、caspase-1、IL-1β）的表达。
纳米颗粒制备采用TA与MnCl₂·4H₂O在25℃下按1:8体积比搅拌，调节pH至约6.5，加入PVP超声10分钟，离心洗涤获得TMP NPs。通过透射电镜、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱和热重分析表征其形貌、组成和载药量。平均水合粒径约180 nm，有机组分含量超过73.2%。ROS清除能力通过ABTS、DPPH自由基清除实验及电子顺磁共振检测•OH和O₂•⁻清除能力验证。
水凝胶平台制备为200 mL去离子水中溶解2 g Alg和0.78 g PBA，加入EDC-HCl搅拌过夜，透析冻干得到Alg-PBA。TMP NPs与PVA溶液混合超声后与Alg-PBA溶液直接混合，数秒内成胶。通过流变学测试、SEM、EDS和体外药物释放实验表征其力学性能、微观结构和ROS响应释放特性。在400 μM H₂O₂环境下，水凝胶12小时降解约50%，48小时几乎完全降解；在PBS中仅轻微变化，说明平台具备ROS浓度依赖性降解行为。
细胞实验使用6周龄雄性SD大鼠髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs），经阿利新蓝染色和Col-II免疫荧光鉴定。以IL-1β（40 ng/mL）诱导NPCs焦亡模型。通过CCK-8、乳酸脱氢酶释放、钙黄绿素/PI染色、扫描电镜观察膜孔、免疫荧光和Western blot检测NLRP3、caspase-1、GSDMD及GSDMD-NT蛋白表达。转录组学分析使用Illumina NovaSeq 6000平台，对IL-1β处理组和TMP@Alg-PBA/PVA处理组进行差异表达基因（DEGs）的GO和KEGG通路富集分析，并通过IL-17抑制剂干预验证通路作用。
动物实验采用6周龄雄性SD大鼠尾椎Co7-8节段注射IL-1β（40 μg/mL, 5 μL）建立IVDD模型。3天后分组注射PBS、Alg-PBA/PVA凝胶、含100 μg/mL或200 μg/mL TMP的TMP@Alg-PBA/PVA凝胶各10 μL。4周和8周后行X线和MRI检查，计算椎间盘高度指数（DHI%）及Pfirrmann分级，并进行HE、番红O-固绿染色、免疫组化和免疫荧光分析。
三、主要结果
临床样本结果显示，随着Pfirrmann分级从III到V级，Col-II和Aggrecan表达显著下降，而NLRP3、caspase-1和IL-1β表达随退变程度加重而升高，证实氧化应激、焦亡和ECM降解在IVDD进展中的关键作用。
TMP NPs表征表明其带负电荷，在PBS和DMEM/F12中稳定性良好；XPS显示Mn以Mn²⁺、Mn³⁺和Mn⁴⁺形式存在，其中低价态Mn有利于胶原重塑，高价态Mn可高效清除ROS。ABTS和DPPH实验显示TMP在100 μg/mL时清除率超过70%，且具有浓度依赖性。EPR结果证实TMP在50 μg/mL时能显著降低•OH和O₂•⁻信号强度。细胞内ROS检测显示IL-1β刺激后DCFH-DA荧光显著增强，TMP处理后荧光强度随浓度增加而减弱，流式细胞术与半定量分析结果一致。JC-1染色显示TMP可恢复线粒体膜电位，减轻线粒体功能障碍。
水凝胶平台流变测试显示其储能模量G′大于损耗模量G″，具有剪切变稀行为和自愈合性能。体外释放实验显示无H₂O₂时NP累积释放率低，加入H₂O₂后释放率显著增加，证明该平台能在ROS环境中按需释放TMP NPs。
细胞摄取实验显示TMP-Cy5在NPCs中的摄取随浓度（100–400 μg/mL）和时间（0–24 h）增加，8小时内达到约70%摄取率。共定位分析显示TMP NPs成功逃逸溶酶体并靶向线粒体，Pearson相关系数约0.65。细胞活力实验显示TMP@Alg-PBA/PVA能浓度依赖性地提高IL-1β处理后的NPCs存活率，LDH释放显著减少。扫描电镜显示IL-1β组细胞膜表面出现明显孔洞和球状突起，而治疗组细胞形态完整。Western blot和免疫荧光证实TMP@Alg-PBA/PVA能显著抑制NLRP3、caspase-1和GSDMD-NT的表达，而凋亡相关蛋白改变不明显，说明该平台主要通过抗焦亡而非抗凋亡发挥作用。
转录组学分析鉴定出2967个DEGs，其中1472个上调、1495个下调。KEGG通路富集显示IL-17信号通路、TNF信号通路等在治疗组中被显著抑制。GSEA分析证实IL-17通路显著下调。Western blot验证了IL-17/ERK通路中IL-17A、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2及下游焦亡蛋白NLRP3、caspase-1、GSDMD-NT在IL-1β处理后升高，TMP@Alg-PBA/PVA与IL-17抑制剂的干预均能逆转这种变化。该研究首次在IVDD中明确IL-17/ERK通路参与焦亡调控。
ECM相关实验显示IL-1β显著降低Aggrecan和Col-II的mRNA及蛋白表达，升高MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5表达，降低TIMP-1表达。TMP@Alg-PBA/PVA干预后，Aggrecan和Col-II表达回升，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5被抑制，TIMP-1升高，说明平台能减轻炎症环境下的ECM降解。
动物实验结果：X线和MRI显示PBS组和凝胶组DHI%显著下降，骨赘形成增加，MRI T2加权信号降低；高剂量组DHI%保持接近假手术组，T2信号增强。组织学染色显示高剂量组椎间盘结构边界清晰，髓核组织保留较好，纤维化程度低。免疫组化显示高剂量组Col-II和Aggrecan表达显著高于PBS组，与假手术组无显著差异。免疫荧光显示PBS组和凝胶组caspase-1和GSDMD荧光强度随时间增强，高剂量组两种蛋白几乎不表达，证明该平台在体内也能有效抑制焦亡。
四、结论与价值
本研究开发了一种多功能ROS响应性金属-酚网络释放平台TMP@Alg-PBA/PVA，并系统验证了其通过清除ROS、抑制IL-17/ERK信号通路介导的细胞焦亡及减轻ECM降解来延缓IVDD进展的作用。与单纯纳米溶液相比，水凝胶平台减少了注射后纳米颗粒向脊髓等关键部位扩散的风险，更适合椎间盘局部注射治疗。平台具备良好的生物相容性、可注射性和自愈合性能，具有临床转化前景。
五、研究亮点
第一，平台利用苯硼酸酯键对ROS的响应性，实现纳米颗粒在退变部位按需释放，提高了药物利用效率和局部安全性。第二，TMP NPs由TA、Mn²⁺和PVP自组装形成，制备工艺简单，适合规模化生产。第三，首次在IVDD模型中证实IL-17/ERK信号通路调控细胞焦亡，为IVDD分子治疗提供新靶点。第四，平台同时作用于氧化应激、焦亡和ECM降解三个关键病理环节，展示了多功能协同治疗的潜力。