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1. 研究团队与发表信息
本研究由日本多个机构的学者合作完成，主要作者包括Mikako Nishida（Okayama University）、Nahoko Yamashita（Okayama University）、Taisaku Ogawa（RIKEN BDR）等，通讯作者为Okayama University的Heiichiro Udono教授。研究于2021年发表在*Journal for Immunotherapy of Cancer*（J Immunother Cancer 2021;9:e002954），采用开放获取形式。

2. 学术背景
科学领域：该研究属于肿瘤免疫学与代谢调控的交叉领域，聚焦二甲双胍（metformin, Met）的抗肿瘤免疫机制。
研究动机：尽管Met作为2型糖尿病一线药物已被证实可降低癌症发病率，并与抗PD-1抗体（anti-PD-1 ab）联合使用时表现出协同疗效，但其具体机制尚不明确。
背景知识：
- Met通过抑制线粒体呼吸链复合物I产生活性氧（mtROS），但其在免疫调控中的作用未被阐明。
- NRF2（NF-E2-related factor 2）是氧化应激应答的关键转录因子，p62/SQSTM1是自噬标志物，二者在肿瘤微环境（TME）中的功能有待探索。
研究目标：揭示Met依赖的mtROS如何通过NRF2/mTORC1/p62轴激活CD8+肿瘤浸润T细胞（CD8TILs），并阐明其与抗PD-1抗体的协同机制。

3. 研究流程与方法
研究对象与样本量：
- 小鼠模型：BALB/c和C57BL/6小鼠（每组n=5×2），构建Meth A纤维肉瘤和B16-OVA黑色素瘤模型。
- 基因工程小鼠：通过交叉Granzyme B-Cre小鼠与NRF2或p62条件性敲除（floxed）小鼠，获得CD8TILs特异性敲除模型。

实验流程：
1. mtROS与抗肿瘤效果验证：
- 使用Mitotempo（线粒体超氧化物清除剂）处理荷瘤小鼠，验证Met依赖的mtROS作用。
- 流式细胞术检测CD8TILs中Glut-1（葡萄糖转运体）、mtROS、IFN-γ等标志物。

1. NRF2/mTORC1/p62轴激活机制：

   • 通过RNA测序分析CD8TILs和肿瘤细胞的转录组。
     
   • 使用抑制剂（如Ochratoxin A抑制NRF2、Rapamycin抑制mTORC1）验证通路依赖性。
     
   • 检测磷酸化p62（Ser351和Ser403）在NRF2激活中的作用。
     

2. 代谢重编程分析：

   • Seahorse能量代谢分析仪测定肿瘤细胞的糖酵解（ECAR）和氧化磷酸化（OCR）。
     
   • 体外实验补充α-酮戊二酸（αKG）验证谷氨酰胺代谢的作用。
     

3. IFN-γ信号依赖实验：

   • 构建IFN-γ受体（IFNγR）缺失的B16-Fucci δIC肿瘤模型，分析CD8TILs功能。
     

创新方法：
- 条件性敲除小鼠模型：首次在CD8TILs中特异性敲除NRF2或p62，明确其细胞自主性功能。
- p62磷酸化位点分析：揭示mTORC1通过p62（Ser351）磷酸化激活NRF2的反馈环路。

4. 主要结果
结果1：Met通过mtROS激活NRF2/mTORC1/p62轴
- Mitotempo可完全阻断Met（而非抗PD-1抗体）的抗肿瘤效果（p<0.01），证明Met依赖mtROS。
- Met诱导CD8TILs中Glut-1表达升高，促进糖酵解和IFN-γ分泌（流式数据支持）。

结果2：NRF2与mTORC1的反馈环路
- NRF2敲除小鼠中，Met无法激活mTORC1（p-S6水平降低），且CD8TILs增殖（Ki67+）显著减少。
- mTORC1抑制剂Rapamycin抑制p62（Ser351）磷酸化，阻断NRF2核转位，证实双向调控。

结果3：自噬-谷氨酰胺代谢驱动mTORC1激活
- Met通过NRF2上调自噬标志物LC3B和p62（Ser403），促进谷氨酰胺分解生成αKG。
- 氯喹（自噬抑制剂）阻断mTORC1激活，而外源DM-αKG可逆转此效应（p<0.001）。

结果4：IFN-γ依赖的肿瘤代谢重编程
- 联合治疗显著增加CD8TILs分泌IFN-γ，导致肿瘤细胞糖酵解和OXPHOS双下调（Seahorse数据）。
- IFNγR缺失肿瘤中，CD8TILs的增殖与Glut-1表达完全丧失，证实IFN-γ信号的关键作用。

5. 结论与价值
科学意义：
- 首次阐明Met通过mtROS-NRF2-mTORC1-p62反馈环路激活CD8TILs的分子机制。
- 提出“免疫-代谢对话”新范式：CD8TILs的代谢重编程直接调控肿瘤细胞能量代谢。

应用价值：
- 为Met与免疫检查点抑制剂的联合治疗提供理论依据。
- 提示葡萄糖补充或靶向p62磷酸化可作为增强免疫治疗的策略。

6. 研究亮点
- 机制创新：发现NRF2/mTORC1/p62的正反馈环路，突破传统线性信号认知。
- 方法学创新：构建CD8TILs特异性敲除模型，实现精准细胞类型解析。
- 临床关联性：揭示IFN-γ信号在TME重塑中的核心地位，为耐药性研究提供新靶点。

7. 其他价值
- 研究数据提示肿瘤血管正常化可能通过NRF2介导，为后续研究指明方向。
- 公开的RNA-seq数据（GSE编号未提供）可用于跨研究验证。