学术研究报告:单细胞分辨率空间蛋白质组学新方法PSPRO的建立与应用
一、研究团队与发表信息
本研究由南方科技大学化学系与化学生物学及组学分析研究中心的Yiheng Mao、Yuan Li、Zhendong Zheng等共同完成,通讯作者为Ruijun Tian(邮箱:tianrj@sustech.edu.cn)。研究成果于2025年6月18日发表于Cell Systems期刊(卷16,文章编号101291),标题为《All-at-once spatial proteome profiling of complex tissue context with single-cell-type resolution by proximity proteomics》。
二、学术背景与研究目标
科学领域:本研究属于空间蛋白质组学(Spatial Proteomics)与邻近标记技术(Proximity Labeling)交叉领域。
研究动机:传统空间蛋白质组学技术(如激光显微切割-质谱联用LMD-MS和抗体成像)在采样精度、通量和覆盖范围之间存在权衡,难以同时实现单细胞分辨率和全蛋白质组覆盖。
背景知识:
1. 组织微环境由异质性细胞组成,其空间分布对生理或病理功能至关重要。
2. 现有技术中,LMD-MS需逐一切割细胞,效率低;抗体成像虽分辨率高(亚微米级),但通量有限。
3. 酪胺信号放大技术(TSA, Tyramide Signal Amplification)可通过HRP催化生物素标记靶蛋白邻近区域,但此前多用于亚细胞结构研究。
研究目标:开发一种名为PSPRO(Proximity Labeling for Spatial Proteomics)的新方法,结合抗体靶向邻近标记与高效亲和纯化,实现单次实验中对复杂组织切片内特定细胞类型的全蛋白质组捕获,并揭示空间异质性。
三、研究流程与方法
1. 方法建立与优化
- 邻近标记体系设计:
- 使用靶向细胞标志物的抗体(如Epcam标记癌细胞)结合HRP偶联二抗,在H₂O₂存在下催化生物素-萘胺(Biotin-Naphthylamine)标记靶细胞三维空间内的蛋白质。
- 通过免疫荧光(IF)和质谱(MS)双通道评估标记参数(探针浓度、反应时间、H₂O₂浓度),筛选出最优条件(1 μM探针、500 μM H₂O₂、5分钟反应)。
- 测试12种HRP底物探针(如BP1、BN2等),最终选择BN2(生物素-苯胺衍生物),因其标记选择性和蛋白质覆盖度最佳。
2. 性能验证与基准测试
- 对比实验:
- 将PSPRO与流式细胞分选(FACS)和LMD-MS对比,使用小鼠胰腺肿瘤组织。
- 结果:PSPRO可富集数千种蛋白质,与FACS和LMD-MS覆盖度相当(如Epcam+癌细胞中鉴定出>3,500种蛋白质),且标志物排序一致(如KRT19、CDH1、MUC6)。
- 主成分分析(PCA)显示三种方法虽有偏差,但核心细胞类型特异性蛋白质组高度一致。
3. 应用案例
- 胰腺肿瘤微环境:
- 在10 μm厚切片中,PSPRO成功区分癌细胞(Epcam+)、CAFs(Col1A1+)和免疫细胞(CD45+),富集特异性标志物(如癌细胞中的EPCAM、CAFs中的COL1A1、免疫细胞中的CD45)。
- 功能分析显示,癌细胞富集上皮形态发生通路,CAFs富集细胞外基质组织通路,免疫细胞富集免疫系统过程通路。
4. 空间异质性分析(LMD-PSPRO联用)
- 技术整合:
- 结合激光显微切割(LMD)和全集成SpinTip亲和纯化质谱技术(FISAP),分析同一切片内不同形态区域(如胰腺肿瘤早期与晚期区域)。
- 结果:早期区域富集腺泡细胞标志物(如CTRB1),晚期区域富集胰腺导管腺癌标志物(如ERBB2),并通过免疫组化(IHC)验证ERBB2的空间表达差异。
四、主要结果与逻辑关联
1. 标记优化:BN2探针和Col1A1抗体的选择奠定了高特异性基础(图1-2)。
2. 性能验证:PSPRO在通量和分辨率上弥补了FACS和LMD的不足(图3)。
3. 应用拓展:在胰腺肿瘤和脾脏中成功解析细胞类型特异性蛋白质组,并发现空间异质性(图4-5)。
4. 技术升级:LMD-PSPRO联用揭示了同一组织内不同区域的分子差异(图6),如免疫细胞在肿瘤与淋巴结构中的分布差异(髓系细胞在肿瘤中富集,淋巴细胞在淋巴结构中富集)。
五、研究结论与价值
科学价值:
1. 将传统“抗体-表位”检测范式转化为“抗体-细胞类型蛋白质组”分析,为空间生物学提供新工具。
2. 通过优化邻近标记参数,实现了单细胞分辨率下数千种蛋白质的同步捕获。
应用价值:
1. 适用于临床FFPE样本,助力肿瘤微环境和免疫治疗研究。
2. 可与其他技术(如单细胞转录组)互补,推动多组学整合分析。
局限性:
1. 依赖抗体质量和靶标丰度;
2. 背景信号需进一步降低;
3. 目前仅支持单次单一蛋白质组富集。
六、研究亮点
1. 方法创新:首次将邻近标记技术应用于全细胞蛋白质组捕获,突破亚细胞结构限制。
2. 高通量:单次实验可分析10种细胞类型,覆盖>4,500种蛋白质。
3. 空间分辨率:结合LMD实现亚区域比较(如早期vs晚期肿瘤),揭示分子异质性。
4. 跨平台兼容性:适配冷冻和FFPE样本,与现有临床病理流程无缝衔接。
其他价值:
- 公开质谱数据(ProteomeXchange: MSV000093995),促进方法复现。
- 为开发多路复用标记技术(如点击化学)提供基础。
(报告字数:约2000字)